工程化改造制造技术

本发明专利技术公开了新型

【技术实现步骤摘要】
工程化改造AcrIIA25.1蛋白进行化学可控基因编辑的方法
[0001]本专利技术为申请日为
2022
年
02
月
11
日
、
申请号为
CN 202210127749.7、
专利技术名称为新型
CRISPR
‑
Cas9
抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法的中国专利技术专利申请的分案申请
。


[0002]本专利技术属于生物
，具体涉及新型
CRISPR
‑
Cas9
抑制蛋白及其改造应用于化学可控的基因编辑的方法
。

技术介绍

[0003]成簇的规律间隔的短回文重复序列
(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
，
CRISPR)
及其
CRISPR
相关蛋白
(CRISPR
‑
associated
，
Cas)
构成了原核生物适应性免疫防御系统，以防御包括噬菌体和质粒在内的侵入性遗传元件
。CRISPR
‑
Cas
介导的防御过程可分为三个阶段：
(1)
适应阶段：当噬菌体入侵时，噬菌体的一部分序列信息作为新的间隔子插入到细菌的
CRISPR
基因座，形成免疫记忆；
(2)
表达阶段：系统表达
Cas
基因以及加工形成成熟的
CRISPR RNA(crRNA)
；
(3)
干扰阶段：
Cas
蛋白在
crRNA
的引导下识别并破坏靶向核酸，形成免疫防御
。
目前基于系统发生树以及作用机制，
CRISPR
‑
Cas
系统分为2大类
(Class 1
和
Class 2)
，6种类型
。Class 1
系统
(
包括
I、III
和
IV
型
)
使用多亚基
Cas
蛋白复合物靶向外源核酸；而
Class 2
系统
(
包括
II、V
和
VI
型
)
则依靠单一效应蛋白
(
如
Cas9)
来实现干扰，因而应用广泛
。
截止目前，
Class 2CRISPR
‑
Cas
系统的多种亚型被鉴定并开发为多种强有力的基因编辑工具，主要包括
CRISPR
‑
Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)
等
。
它们在科学研究
、
农业
、
畜牧业以及临床检测治疗等领域发挥着日益重要的作用
。
其中来自化脓链球菌
(Streptococcus pyogenes)
的
Cas9(SpyCas9)
是应用最为广泛的
Cas
效应物，并且已被发展成为一系列强有力的基因编辑工具
。
[0004]然而，尽管近些年
CRISPR
基因编辑技术得到了长足发展，它仍面临着尚未解决的脱靶问题，使
CRISPR
基因编辑技术的应用受到了阻碍
。
为了解决这一问题，有些研究通过改造
Cas
蛋白或者向导
RNA
以提升靶向识别的特异性，或者通过可控的
Cas
蛋白或者导向
RNA
丰度与时间的表达来进一步降低脱靶效应
。
近年来，在原噬菌体或噬菌体中发现了一系列被称为
anti
‑
CRISPR(Acr)
的蛋白，它们可以抑制多种
CRISPR
‑
Cas
系统的活性，并且一些
Acr
蛋白
(
如
AcrIIA4)
被证明在细胞中可以通过抑制
Cas9
活性来降低脱靶效应
。
这些特性使得
Acr
可作为潜在的“开关”工具用于调控基于
CRISPR
的应用，因此
Acr
的探索及其分子机制研究对于基因编辑领域有着十分重要的意义
。
[0005]Acr
蛋白是噬菌体为了对抗原核生物
CRISPR
‑
Cas
系统进化出来的一种策略，即通过编码蛋白质
(
即
Acr
蛋白
)
来失活原核生物的
CRISPR
‑
Cas
系统
。
研究发现
Acr
蛋白广泛分布于噬菌体
、
原噬菌体以及侵入性遗传元件中，它们的分子量一般较小，约
50
‑
200
氨基酸，并且展现出高度的序列多样性
。
迄今为止，
88
种不同类型的
Acr
蛋白家族已被鉴定出来，能够广泛抑制
I、II、III、V
和
VI
型
CRISPR
‑
Cas
系统
。
由于
Acr
蛋白种类繁多，并展现出高度的序列
多样性，因此很难通过常规的序列同源性比对方法来进行寻找
。
科学家已经利用多种生物信息以及生物化学等方法来寻找并确认
Acr
蛋白，包括基于
Guilt
‑
by
‑
association、Self
‑
targeting、Machine
‑
learning
的生物信息学方法，以及通过
Phage
‑
first
和
High
‑
throughput
的生物化学方法
。
值得注意的是，已经通过多种方法发现了
23
种
AcrIIA
家族
。
目前，只有一小部分
AcrIIA
蛋白的分子机制被详细地阐明
。
研究显示这些
AcrIIA
蛋白主要抑制
CRISPR
‑
Cas9
免疫的第三个阶段
——
干扰阶段，并可粗略地分为三种策略：
(1)
干扰
Cas
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.AcrIIA
蛋白在细胞或真核生物中抑制
Cas9
基因编辑
、
调控和
/
或成像中的应用；所述
AcrIIA
蛋白为
AcrIIA25
或
AcrIIA25.1
蛋白；所述
AcrIIA25
蛋白为如下
b1)
或
b2)
：
b1)
氨基酸序列是
SEQ ID NO:2
所示的蛋白质；
b2)
在
SEQ ID NO:2
所示的蛋白质的
N
端或
/
和
C
端连接标签得到的融合蛋白质；所述
AcrIIA25.1
蛋白为如下
c1)
或
c2)
：
c1)
氨基酸序列是
SEQ ID NO:3
所示的蛋白质；
c2)
在
SEQ ID NO:3
所示的蛋白质的
N
端或
/
和
C
端连接标签得到的融合蛋白质；所述
Cas9
蛋白为
SpyCas9
蛋白或
/
和
St3Cas9
蛋白
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述细胞为细菌细胞
。3.
权利要求1中所述
AcrIIA
蛋白在抑制
Cas9
蛋白活性中的应用；所述
Cas9
蛋白为
SpyCas9
蛋白或
/
...

【专利技术属性】
技术研发人员：iAcr，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：