一种基于基因编辑技术的制造技术

本发明专利技术公开一种名为

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因编辑技术的DNA克隆技术


[0001]本专利技术涉及一种名为
CRISPRshuttle
的基于基因编辑技术的新一代简单
、
适合高通量的
DNA
克隆技术
。
具体涉及利用基因编辑技术
CRISPR
切割原质粒的载体公共序列，从而将目的
DNA
片段从原质粒上切割游离下来；在目的载体中插入
CRISPRshuttle
穿梭盒序列并使其线性化；再运用无缝克隆技术将目的
DNA
片段和线性化的含
CRISPRshuttle
穿梭盒的目的载体连接，然后转化大肠杆菌制备目的质粒
。
对于使用相同载体的不同质粒，本专利技术使得这些不同质粒上的目的
DNA
片段转移至其它相同目的载体的操作，在转化大肠杆菌之前，简化为统一两步试管反应，较现有技术具有简单
、
高效
、
经济的优点
。

技术介绍

[0002]质粒<br/>(plasm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种把目的
DNA
片段从原质粒克隆到目的载体的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、
利用基因编辑技术切割原质粒，将原质粒上带有5’
端上游及3’
端下游邻近的原载体公共序列的目的
DNA
片段从原质粒上切割下来，所述的切割下来的物质含有式
I
所述的序列结构：
C1
‑
D
‑
C2(
式
I)
，其中，
C1
为原质粒上的目的
DNA
片段的5’
端上游邻近的原载体公共序列，
D
为目的
DNA
片段，
C2
为原质粒上的目的
DNA
片段的3’
端下游邻近的原载体公共序列；
S2、
提供或构建两端带有克隆辅助序列的
CRISPRshuttle
穿梭盒，所述的
CRISPRshuttle
穿梭盒序列从5’
端到3’
端依次为步骤
S1
中所述的式
I
中的
C1、1
‑2种限制性内切酶识别序列
、
以及步骤
S1
中所述的式
I
中的
C2
，所述的
CRISPRshuttle
穿梭盒序列中1‑2种限制性内切酶识别序列只存在于
CRISPRshuttle
穿梭盒序列而不存在于步骤
S3
中制备的含有
CRISPRshuttle
穿梭盒的目的载体中
CRISPRshuttle
穿梭盒以外的序列里，也不存在于步骤
S1
中所述的式
I
中的
C1、C2
中；所述的克隆辅助序列是便于应用
DNA
克隆技术将
CRISPRshuttle
穿梭盒序列插入目的载体而在
CRISPRshuttle
穿梭盒序列两端添加的序列；
S3、
用
DNA
克隆技术将
CRISPRshuttle
穿梭盒插入目的载体制备含有
CRISPRshuttle
穿梭盒的目的载体；
S4、
用能识别
S2
中所述的
CRISPRshuttle
穿梭盒序列中限制性内切酶识别序列的限制性内切酶将步骤
S3
制备的含有
CRISPRshuttle
穿梭盒的目的载体线性化；
S5、
运用无缝克隆技术将步骤
S1
中切割下来的所述物质与步骤
S4
制备的已线性化的含有
CRISPRshuttle
穿梭盒的目的载体进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含有目的载体抗生素抗性基因对应的抗生素的培养基上进行培养，挑取克隆进行培养，提取质粒并鉴定，鉴定正确的质粒就是含有目的
DNA
片段的目的质粒，也就证明了已经将目的
DNA
片段从原质粒上克隆到了目的载体上；所述的步骤
S1
与
S2
‑
S4
的顺序不分先后
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤，当目的载体上的抗生素抗性基因与原质粒上的抗生素抗性基因相同时，在步骤
S3
之前，利用
DNA
克隆技术把目的载体上的抗生素抗性基因替换成不同于原质粒上的抗生素抗性基因
。3.
如权利要求1‑2所述的方法，其特征在于，所述权利要求1步骤
S2
中提供或构建的两端带有克隆辅助序列的
CRISPRshuttle
穿梭盒的序列选自如下：针对
pOT2
原载体对应的序列如
SEQ ID NO.21、22
所示；针对
pOTB7
原载体的对应的序列如
SEQ ID NO.45、46
所示；针对
pFLC
‑
I
原载体的对应的序列如
SEQ ID NO.76、77
所示；针对
pBS SK(
‑
)
原载体对应的序列如
SEQ ID NO.122、123
所示；针对
pCR2.1
原载体对应的序列如
SEQ ID NO.167、168
所示；针对
pDNR
‑
Dual
原载体对应的序列如
SEQ ID NO.220、221
所示；针对
pLX304
原载体对应的序列如
SEQ ID NO.236、237
所示
。4.
如权利要求1‑3所述方法，其特征在于，步骤
S5
中所述的无缝克隆技术选自：
Gibson Assembly、In
‑
Fusion cloning、cotransformation cloning、T5 exonuclease
‑
dependent DNA assembly、Red/ET recombineering、ligation
‑
independent cloning、sequence and ligation
‑
independent cloning、seamless ligation cloning extract、successive hybridization assembling。5.
如权利要求1‑3所述的方法，其特征在于，步骤
S1
中所述的利用基因编辑技术切割原质粒，所述的基因编辑技术选自：
CRISPR
技术
、
锌指核酸酶
(ZFN)
技术和转录激活因子样效
应物核酸酶
(TALEN)
技术
。6.
如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的
CRISPR
技术选自
CRISPR
‑
Cas9
和
CRISPR
‑
Cas12。7.
如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的
CRISPR
‑
Cas9
技术中，
Cas9
选自如下的任一种核酸酶或其有活性的变体：化脓性链球菌
Cas9、
金黄色葡萄球菌
Cas9、
脑膜炎奈瑟氏菌
Cas9、
嗜热链球菌
Cas9、
狗链球菌
Cas9、
空肠弯曲菌
Cas9、
一种生活在热液喷口的细菌
Cas9
或侵肺巴斯德氏菌
Cas9
；所述的
CRISPR
‑
Cas12
技术中，
Cas12
选自如下任一种核酸酶或其有活性的变体：氨基酸球菌
sp.BV3L6
来源的
Cpf1
或毛螺科菌
ND2006
来源的
Cpf1。8.
如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的利用
CRISPR
‑
Cas9
技术切割原质粒，所述的切割步骤包括：
1)
分别根据原质粒上目的片段的5’
端上游邻近的原载体公共序列和3’
端下游邻近的原载体公共序列，设计化脓性链球菌
Cas9
对应的
sgRNA 1
和
sgRNA 2
的靶序列，根据确定的
sgRNA 1
和
sgRNA 2
的靶序列分别制备可用于体外转录
sgRNA 1
和
sgRNA 2
的模板，所述的模板分别含有从5’
端到3’
端式
II(P
‑
T1
‑
S)
和式
III(P
‑
T2
‑
S)
所示的序列结构，其中，
P
为用于体外转录的启动子序列，
T1
为
sgRNA 1
的靶序列，
T2
为
sgRNA 2
的靶序列，
S
为化脓性链球菌
Cas9
对应的
sgRNA
的骨架序列如
SEQ ID NO.23
所示，
“‑”
为键，而且，如果靶序列起始为
GG
，则去掉
P
中末尾的
GG
，如果靶序列起始为
GN
，则去掉
P
中末尾的
G
，如果靶序列起始为
NN
，则保留
P
中末尾两个
GG
；
2)
体外转录制备
sgRNA 1
和
sgRNA 2
；
3)
把化脓性链球菌
Cas9
核酸酶
、
原质粒与上述步骤
2)
中制备的
sgRNA 1、sgRNA 2
混合，在化脓性链球菌
Cas9
核酸酶缓冲液的作用下进行切割
。9.
如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的
sgRNA 1
的靶序列选自下组：原载体为
pOT2
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.1
‑
16
所示；原载体为
pOTB7
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.26
‑
39
所示；原载体为
pFLC
‑
I
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.49
‑
57
所示；原载体为
pBS SK(
‑
)
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.88
‑
112
所示；原载体为
pCR2.1
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.126
‑
156
所示；原载体为
pDNR
‑
Dual
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.171
‑
208
所示；原载体为
pLX304
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.224
‑
231
所示；所述的
sgRNA 2
的靶序列选自下组：原载体为
pOT2
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.17
‑
18
所示；原载体为
pOTB7
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.40
‑
44
所示；原载体为
pFLC
‑
I
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.58
‑
75
所示；原载体为
pBS SK(
‑
)
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.113
‑
121
所示；原载体为
pCR2.1
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.157
‑
166
所示；原载体为
pDNR
‑
Dual
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.209
‑
219
所示；原载体为
pLX304
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.232
‑
235
所示
。10.
如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的
sgRNA 1
的靶序列选自下组：原载体为
pOT2
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.12
所示；原载体为
pOTB7
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.34
所示；原载体为
pFLC
‑
I
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.51
所示；原
载体为
pBS SK(
‑
)
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.97
所示；原载体为
pCR2.1
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.126
‑
131
所示；原载体为
pDNR
‑
Dual
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.196
所示；原载体为
pLX304
的
sgRNA 1
的靶序列如
SEQ ID NO.224
所示；所述的
sgRNA 2
的靶序列选自下组：原载体为
pOT2
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.17
‑
18
所示；原载体为
pOTB7
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.40
‑
42
所示；原载体为
pFLC
‑
I
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.58
‑
61
所示；原载体为
pBS SK(
‑
)
的
sgRNA 2
的靶序列如
SEQ ID NO.113
‑
115
所示；原载体为
pCR2....

【专利技术属性】
技术研发人员：王纪武，魏平，薛文，刘雪莲，
申请(专利权)人：南华大学附属南华医院，
类型：发明
国别省市：