【技术实现步骤摘要】
一种制备D
‑
塔格糖工程菌的构建方法
[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种制备
D
‑
塔格糖工程菌的构建方法
。
技术介绍
[0002]D
‑
塔格糖是自然界存量较少的一种六碳单糖，是
D
‑
半乳糖的同分异构体，具有低能量
、
降血糖
、
改善肠道菌群
、
抗龋齿等功效，在食品领域具有广阔的应用前景
。
目前生产塔格糖的方法主要有化学合成法和生物转化法，随着环保意识的增强，生物转化法将会逐步取代化学合成法，然而现在生产塔格糖的生物合成法大多为多酶复合体转化法，或者使用成本较高的乳糖作为原料来生产塔格糖，这样不利于推进工业化生产，所以寻求一种单酶单步转化就显得尤为重要
。
根据报道，
D
‑
塔格糖
‑
二磷酸醛缩酶能将果糖单步转化为
D
‑
塔格糖，但是转化效率不高，原料利用率低，提高了生产成本
。
技术实现思路
[0003]本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种制备
D
‑
塔格糖工程菌的构建方法，塔格糖的转化率高，转化步骤少，生产成本低
。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0005]A
：获取目的基因
PCR
引...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种制备
D
‑
塔格糖工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
A
：获取目的基因
PCR
引物
F1
和
R1
，所述
F1
为
SEQ ID NO
：3所示的核苷酸序列，具体为
GGAATTCATGAAAAAGCACCCCCTAC
，所述
R1
为
SEQ ID NO
：4所示的核苷酸序列，具体为
CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTAGCATTCCGGATGGGT
；
B
：对载体
pYB1s
和
D
‑
塔格糖
‑
二磷酸醛缩酶的
PCR
产物进行
EcoRI/PstI
双酶切，获得
D
‑
塔格糖
‑
二磷酸醛缩酶
PCR
产物片段
、pYB1s
载体片段，所述
D
‑
塔格糖
‑
二磷酸醛缩酶为
SEQ ID NO
：1所示的基因序列，
D
‑
塔格糖
‑
二磷酸醛缩酶具有
SEQ ID NO
：2所示的氨基酸序列；
C
：
D
‑
塔格糖
‑
二磷酸醛缩酶
PCR
产物片段和
pYB1s
载体片段进行酶连，得重组质粒，并转化
DH5
α
感受态，培养，得菌株，命名为
BW25113
‑
WT
；
D
：以上述重组质粒为模板，分别在位点
Y364A、V367N
和
Y364A/V367N
采用突变引物进行
PCR
扩增反应，并经
DpnI
消化模板和转化
DH5
α
感受态，培养，得制备
D
‑
塔格糖工程菌，分别命名为
BW25113
‑
Y364A、BW25113
‑
V367N
和
BW25113
‑
Y364A/V367N
，其中位点
Y364A
的突变引物为
F2
和
R2,
所述
F2
为
SEQ ID NO
：5所示的核苷酸序列，具体为
GACCGCCTGCGCGCGTACTGGGTTT
，所述
R2
为
SEQ ID NO
：6所示的核苷酸序列，具体为
AAACCCAGTACGCGCGCAGGCGGTC
；位点
Y367N
的突变引物为
F3
和
R3,
所述
F3
为
SEQ ID NO
：7所示的核苷酸序列，具体为
GCTA TTACTGGNNKTTGCCGGAAGT
，所述
R3
...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱理平，徐良平，申莹莹，陈科材，
申请(专利权)人：东台市浩瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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