一种生物发酵法制备稳定同位素标记制造技术

本发明专利技术提供了一种生物发酵法制备稳定同位素标记的单链

【技术实现步骤摘要】
一种生物发酵法制备稳定同位素标记ssDNA的方法


[0001]本专利技术属于
DNA
合成
，具体涉及一种生物发酵法制备稳定同位素标记
ssDNA
的方法
。

技术介绍

[0002]大部分
DNA
以双螺旋结构存在，是双链的存在形式，但一经热或碱处理就会变为单链状态
。
单链
DNA(single
‑
stranded DNA
，
ssDNA)
就是指以这种状态存在的
DNA。ssDNA
在分子流体力学性质
、
吸收光谱
、
碱基反应性质
、
三维结构及功能等方面都和双链
DNA(dsDNA)
不同
。
值得注意的是，
ssDNA
可以折叠形成三维结构，在生命过程中扮演重要角色，例如
G
四链体结构被认为是一个有潜力的抗癌药物靶点
。
稳定同位素标记的
ssDNA
可以促进
ssDNA
的三维结构的核磁共振解析
。
[0003]目前市场上获得稳定同位素标记
ssDNA
的方法是固相合成法，但是该方法合成成本昂贵，合成一条
24nt
，
1mg
的
ssDNA
链大约需要
33
万人民币
。
并且，对于高
>GC
含量的样品，制备过程容易出现错乱现象或者二级结构阻碍聚合酶工作等问题
。
因此，发展普适性的稳定同位素标记
ssDNA
的制备方法是该领域亟需解决的问题
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种生物发酵法制备稳定同位素标记
ssDNA
的方法，本专利技术的方法为普适性的稳定同位素
15
N
和
/
或
13
C
标记
ssDNA
的方法，能够有效提高
15
N
和
/
或
13
C
标记的
ssDNA
的体外合成效率，且降低合成成本
。
[0005]本专利技术提供了一种生物发酵法制备稳定同位素标记
ssDNA
的方法，包括以下步骤：
[0006]1)
在目标序列5’
和3’
末端分别添加第一限制性内切酶的位点和第二限制性内切酶的位点，得到重复单元；
[0007]所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶为两个不同的限制性内切酶；
[0008]2)
将步骤
1)
所述重复单元串联，得到融合序列；
[0009]3)
将步骤
2)
所述融合序列插入到高拷贝载体，得到重组载体；
[0010]4)
将步骤
3)
所述重组载体导入宿主菌，得到重组菌；
[0011]5)
对步骤
4)
所述重组菌进行培养后，提取和纯化所述重组菌中的重组载体；所述培养采用的培养基以
15
NH4Cl
为唯一氮源和
/
或以
13
C
‑
葡萄糖为唯一的碳源；
[0012]6)
采用第一限制性内切酶和第二限制性内切酶对步骤
5)
所述重组载体进行酶切，得到不对称的双链
DNA
结构，分离获得长度不等的两条
ssDNA
，所述两条
ssDNA
中一条为目标序列；
[0013]7)
回收步骤
6)
所述两条
ssDNA
中的目标序列，得到稳定同位素标记的靶
ssDNA。
[0014]优选的，步骤
1)
中，所述第一限制性内切酶为
KpnI
且所述第二限制性内切酶为
BamHI
；或者，所述第一限制性内切酶为
KpnI
‑
HF
且所述第二限制性内切酶为
BamHI
‑
HF
；或者，所述第一限制性内切酶为
Pst I
‑
HF
且所述第二限制性内切酶为
Hind
Ⅲ‑
HF
；或者，所述
optimized flip
‑
angle short
‑
transient heteronuclear multiple quantum coherence)
谱图的亚氨基区域，参照物是具有与固相合成相同序列的
ssDNA
；
[0026]图3为类细胞环境与
K
+
稀溶液环境下
wtTel23c
‑
TMPyP4
复合物
sfHMQC
二维谱图比较结果，其中，红色谱图表示
K
+
稀溶液环境下
wtTel23c
‑
TMPyP4
复合物信号；黑色谱图表示类细胞环境
wtTel23c
‑
TMPyP4
复合物信号；
[0027]图4为实施例3中稳定同位素
15
N
标记人类启动子
c
‑
myc ssDNA
的原理图，其中，质粒灰色部分表示
pUC57
载体序列；绿色表示
BsmB I
酶切位点；蓝色部分表示串联重复的目的基因
(PU22)
20
，局部放大图表示1个目的基因单元
PU22(
相比于
PU22C
的差别是5’
端少了一个
C
碱基
)
，省略号表示目的基因重复串联，空心箭头所指序列表示
pUC57
‑
PU22C
经过
Hind III
‑
HF
和
Kpn I
‑
HF
双酶切获得的长度不等的双链
DNA
序列；经过变性聚丙烯胺凝胶电泳纯化获得两条长度不等的
ssDNA
，分别为
PU22C
和
PU30C
；
[0028]图5为实施例5中凝胶检测质粒和酶切质粒结果，其中，
A
为1％的琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的质粒
pUC57
‑
PU22C
；
B
为8％的丙烯酰胺凝胶电泳检测质粒的分步双酶切的结果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种生物发酵法制备稳定同位素标记
ssDNA
的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)
在目标序列5’
和3’
末端分别添加第一限制性内切酶的位点和第二限制性内切酶的位点，得到重复单元；所述第一限制性内切酶和第二限制性内切酶为两个不同的限制性内切酶；
2)
将步骤
1)
所述重复单元串联，得到融合序列；
3)
将步骤
2)
所述融合序列插入到高拷贝载体，得到重组载体；
4)
将步骤
3)
所述重组载体导入宿主菌，得到重组菌；
5)
对步骤
4)
所述重组菌进行培养后，提取和纯化所述重组菌中的重组载体；所述培养采用的培养基以
15
NH4Cl
为唯一氮源和
/
或以
13
C
‑
葡萄糖为唯一的碳源；
6)
采用第一限制性内切酶和第二限制性内切酶对步骤
5)
所述重组载体进行酶切，得到不对称的双链
DNA
结构，分离获得长度不等的两条
ssDNA
，所述两条
ssDNA
中一条为目标序列；
7)
回收步骤
6)
所述两条
ssDNA
中的目标序列，得到稳定同位素标记的靶
ssDNA。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
1)
中，所述第一限制性内切酶为
KpnI
且所述第二限制性内切酶为
BamHI
；或者，所述第一限制性内切酶为
KpnI
‑
HF
且所述第二限制性内切酶为
BamHI
‑
HF
；或者，所述第一限制性内切酶为
Pst I
‑
HF
且所述第二限制性内切酶为
Hind
Ⅲ‑
HF
；或者，所述第一限制性内切酶为
Kpn I
‑
HF
且所述第二限制性内切酶为
Hind III
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王申林，邹梦冰，马常兴，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：