【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物选育，具体涉及一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体及湿菌体制备d-阿洛糖的方法。
技术介绍
1、d-阿洛糖是一种罕见的糖单糖，作为d-阿洛酮糖的异构体而被知晓，它是在3号碳的-oh基团方向上与葡萄糖(d-葡萄糖)不同的差向异构体。d-阿洛糖对血栓形成、器官移植患者的自身免疫反应和癌细胞增殖具有抑制功能。此外，还存在延迟在肝和脑缺血后神经细胞死亡的效果，并且已经作为白血病患者的治疗药物进行了研究。
2、目前合成稀有糖的方法包括化学合成法和生物合成法，通过微生物酶法制备d-阿洛糖具有合成简单、选择性高且副产物低等特点。醛酮异构酶能够催化d-阿洛酮糖进行酮醛异构反应得到d-阿洛糖。中国专利cn108473991公开了由果糖生产阿洛糖的菌株以及使用该菌株生产阿洛糖的方法，其中阿洛糖转化率在12-15％左右，转化率低且成分中含有阿洛酮糖杂糖，增加了分离成本，提高了整体的生产成本。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，得到的d-阿洛糖产品转化率高。
2、为解决上述第一个技术问题，本专利技术的技术方案是：
3、一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，包括以下步骤：
4、a：将醛酮异构酶重组大肠杆菌用灭菌水进行梯度稀释，得到稀释液；
5、b：将步骤a中的稀释液0.08～0.12ml接于选择培养基上，37℃恒温培养8～12h，其中
6、c：挑选步骤b中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为0.5～3mm的一个单菌落，接种于平板培养基上37℃恒温培养8～12h，平板培养基配方为酵母粉4～6g/l、蛋白胨9～11g/l、氯化钠9～11g/l、琼脂粉18～22g/l，其余为去离子水，ph值自然；
7、d：挑选步骤c中颜色均匀单一、菌落凸起、菌落直径为0.5～3mm的一个单菌落，接种于含0.08～0.12mm氰化亚铁的液体lb培养基中，37℃、200～240rpm下恒温培养，得培养菌液，lb培养基中其它组分的配方为酵母粉4～6g/l、蛋白胨9～11g/l、氯化钠9～11g/l，其余为去离子水，ph值自然；
8、e：将步骤d中培养菌液按照发酵培养基0.8～1.2％的体积接种到发酵培养基中，在发酵温度36～38℃、转速230～280rpm下进行发酵，发酵过程中添加0.08～0.12％wt氰化亚铁溶液和诱导剂iptg，23～26℃恒温诱导8～10h，之后2800～3000rpm下离心，得醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体。
9、优选的，步骤a中梯度稀释范围为10-1到10-9。
10、优选的，步骤c中菌落形态颜色为白色、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为2～3mm的菌落。
11、优选的，步骤d中菌落形态为白色、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为1～2mm的菌落。
12、优选的，步骤d中培养菌液的od600值为1.6～1.8。
13、优选的，步骤e中发酵培养基的初始ph值为6.5～7.5。
14、优选的，步骤e中发酵培养基的组成为柠檬酸钠1～3g/l、磷酸二氢钾9～11g/l、磷酸氢二钾2～4g/l、硫酸铵3～5g/l、酵母粉55～65g/l、硫酸镁0.5～0.7g/l。
15、优选的，步骤e中诱导剂iptg的添加量与发酵培养基体积的比例为1～2g/l,氰化亚铁溶液添加量与发酵培养基体积的比例为25～35ml/l。
16、其中步骤a中的醛酮异构酶重组大肠杆菌具体的基因序列为：gtgaccgagc tcgccgcggtgaaagccgcgctcaagacccaggccgtcgagacgccgtcgtgggcgtacggcaactcgggcacccgcttcaaggtgttcgcccagcccggtgtcccgcgcgaccccttcgagaaactggacgacgcggcgaaggtgcacgagttcaccggcgcggccccgaccgtcgccctgcacatcccgtgggaccgggtcgaggactacgccgcgctggcggcgcacgccgagaagcggggcgtgcggatcggcgcgatcaactccaacaccttccaggacgacgactacaggctgggcagcatctgccaccccgacgcggcggtgcgccggaaggccgtcgaccacctgctggagtgctcgacatcatggacgccaccggctcgcgcgacctgaagcttggttcgccgacggcacgaactacccgggacaggacgacatccggtcccggcaggaccggctggcgagggcctggccgaggtgtacgagcggctcggcgaggggcagcggatgctcctggagtacaagctcttcgagccggcgttctacacgacggacgtgccggactggggcacggcgtacgcgcactgtctcaagctgggcgagaaggcccaggtcgtggtcgacacgggacaccacgcgccgggcacgaacatcgagttcatcgtggcgacgctgctgcgggaggggaagctcggcgggttcgacttcaactcgcggttctacgccgacgacgacctgatggtgggtgccgccgacccgttccagctgttccggatcatgtacgaggtggtgcgcgggggcgggttcacctccgacgtggcgttcatgctcgaccagtgccacaacatcgaggcgaagatcccggcgatcatccggtcggtgatgaacgtgcaggaggcgacggcgaaggcgctgctggtcgacggcaccgccctggccgaggcgcaggccgcgggggatgtgctggaggcgaacgcggtgctgatggacgcgtacaacacggacgtgcggccgctgctccgggaagtgcgggaggagtcggggctggaccccgaacccatgaaggcgtaccgctcctgcgggtgggcggagaaggtcgttgccgagcggatcggtgggcagcaggccgggtggggggcgtag。
17、本专利技术所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备d-阿洛糖的方法，得到的d-阿洛糖纯度和转化率高。
18、为解决上述第二个技术问题，本专利技术的技术方案是：
19、一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备d-阿洛糖的方法，包括以下步骤：
20、f：将步骤e中醛酮本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤A中梯度稀释范围为10-1到10-9。
3.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤C中菌落形态颜色为白色、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为2～3mm的菌落。
4.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤D中菌落形态为白色、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为1～2mm的菌落。
5.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤D中培养菌液的OD600值为1.6～1.8。
6.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤E中发酵培养基的初始pH值为6.5～7.5。
7.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤E中发酵培养基的组成为柠檬酸钠1～3g/L、磷酸二氢钾9～11g/L、磷
8.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤E中诱导剂IPTG的添加量与发酵培养基体积的比例为1～2g/L,氰化亚铁溶液添加量与发酵培养基体积的比例为25～35mL/L。
9.一种利用权利要求1-8中任一项所述的醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备D-阿洛糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体制备D-阿洛糖的方法，其特征在于：步骤F中所述醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体加入量与底物体积的比为25～35g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤a中梯度稀释范围为10-1到10-9。
3.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤c中菌落形态颜色为白色、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为2～3mm的菌落。
4.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤d中菌落形态为白色、菌落凸起、表面圆润光滑、菌落直径为1～2mm的菌落。
5.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤d中培养菌液的od600值为1.6～1.8。
6.如权利要求1所述的一种醛酮异构酶重组大肠杆菌湿菌体的制备方法，其特征在于：步骤e中发酵培养基的初始ph值为6...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱理平，徐良平，马旭，淮建路，
申请(专利权)人：东台市浩瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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