【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及代谢工程，尤其是一种增强盐单胞菌葡萄糖分解代谢效率的代谢调控策略以及工程改造的盐单胞菌。
技术介绍
1、代谢工程是一门重新连接细胞代谢以增强天然代谢物的产生或赋予细胞产生新产品的能力的科学。代谢工程改造技术的发展使多种化工产品的生产成为可能，包括燃料、化学品、食品、饲料和药品的生产。对微生物的代谢工程改造需要基因编辑技术的发展，以pseva321为载体构建的系列质粒可用于大肠杆菌，嗜盐单胞菌和假单胞菌等微生物的基因过表达，位点特异性重组技术可用于将大片段基因整合到嗜盐单胞菌的基因组中，crispr/aid可用于大肠杆菌和嗜盐单胞菌的基因敲除，自杀质粒可用于大肠杆菌和嗜盐单胞菌以及假单胞菌等微生物的基因插入和敲除。
2、乙酰辅酶a是细胞内的构建单体，多种细胞内的物质都由乙酰辅酶a合成。在乙酰辅酶a的合成中，需由丙酮酸脱去一份子的二氧化碳得到。这一过程中会损失1/3的碳原子，造成了碳原料的浪费和温室气体的排放。在乙酰辅酶a的下游利用上，生物体内大量物质都由乙酰辅酶a合成。如脂肪酸、聚羟基脂肪酸、氨基酸等多种生物分子。
3、现通过调节微生物的中心碳代谢以开发一种高效的葡萄糖分解代谢途径，可进一步加强乙酰辅酶a衍生的合成代谢，对于生产乙酰辅酶a衍生的生物产品有重要的科学意义。
技术实现思路
1、本申请提供了一种增强盐单胞菌葡萄糖分解代谢效率的代谢调控策略，包括对碳代谢的调控。例如引入异源的非氧化糖酵解(non-oxidative glycolysis，
2、碳源过剩和氮源缺乏会促进phb的积累，降低氮源浓度会促进phb合成但是阻细胞生长，不利于phb产能的进一步提升，提升氮源浓度会促进细胞生长但是抑制phb积累，导致phb生产和细胞生长不能同步提升的失衡现象。通过优化氮源培养平衡phb积累和细胞生长以实现在高氮条件下有效积累phb以提高phb的产能。进一步优化培养基中无机盐的组成和浓度，以增强异源通路分解碳源的效率，大幅提高了碳源向代谢产物(例如pha)的转化。具体方案如下：
3、本专利技术第一方面，提供一种工程改造的盐单胞菌(halomonas)，所述的盐单胞菌中引入非氧化糖酵解通路(non-oxidative glycolysis,nog)，和/或，所述的盐单胞菌中引入苹果酰辅酶a-甘油酸(malyl-coa-glycerate,mcg)通路。
4、所述的非氧化糖酵解通路中，磷酸转酮酶将3分子6-磷酸果糖(f6p)分解为3分子乙酰磷酸(acp)和3分子4-磷酸赤藓糖(e4p)，3分子e4p通过碳重排重新生成2分子f6p，再次进入循环，即所述的非氧化糖酵解通路中，净反应是1分子的f6p生成3分子acp而没有碳损失。
5、所述的苹果酰辅酶a-甘油酸通路将2分子磷酸烯醇丙酮酸和2分子二氧化碳转化成2分子草酰乙酸，2个草酰乙酸分子被还原为苹果酸并进一步裂解为2分子乙酰辅酶a和2分子乙醛酸，2分子的乙醛酸转化为1分子羟基丙二酸半醛和1分子二氧化碳，在羟基丙二酸半醛还原酶和甘油酸激酶的作用下生成2-磷酸甘油酯，2-磷酸甘油酯在烯醇化酶的催化下生成1分子磷酸烯醇丙酮酸，再次进入循环，即所述的苹果酰辅酶a-甘油酸通路中，净反应是1分子磷酸烯醇丙酮酸和1分子二氧化碳转化为2分子乙酰辅酶a。
6、所述的盐单胞菌表达或过表达非氧化糖酵解通路的酶，和/或，所述的盐单胞菌表达或过表达苹果酰辅酶a-甘油酸通路的酶。
7、所述的非氧化糖酵解通路的酶包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶、磷酸酮醇酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶、磷酸丙糖异构酶或果糖-1,6-二磷酸醛缩酶中的一种或两种以上。
8、所述的苹果酰辅酶a-甘油酸通路的酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰-coa裂解酶、乙醛酸聚醛酶、羟基丙二酸半醛还原酶、甘油酸激酶、烯醇化酶或乙醇酸脱氢酶中的一种或两种以上。
9、所述的盐单胞菌表达或过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶、磷酸酮醇酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶、磷酸丙糖异构酶或果糖-1,6-二磷酸醛缩酶中的一种或两种以上，和/或，所述的盐单胞菌表达或过表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰-coa裂解酶、乙醛酸聚醛酶、羟基丙二酸半醛还原酶、甘油酸激酶、烯醇化酶或乙醇酸脱氢酶中的一种或两种以上。
10、优选的，所述的盐单胞菌表达或过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶或磷酸酮醇酶中的一种或两种以上，和/或，所述的盐单胞菌表达或过表达苹果酸硫激酶、苹果酰-coa裂解酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上。
11、进一步优选的，所述的盐单胞菌表达或过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶和磷酸酮醇酶，和/或，所述的盐单胞菌表达或过表达苹果酸硫激酶、苹果酰-coa裂解酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来源于埃希氏菌属(escherichia)、明串珠菌属(leuconostoc)或甲基菌属(methylobacillus)中的一种或两种以上，优选的，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来源于大肠杆菌(escherichia coli)、乳明串珠菌(leuconostoc lactis)或鞭毛甲基小杆菌(methylobacillusflagellatus)中的一种或两种以上，进一步优选的，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来源于大肠杆菌(escherichia coli)s17-1。
12、所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的氨基酸序列包括seq id no：9或与seq id no：9具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％以上同源性的氨基酸序列，优选的，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因为gnd，其核苷酸序列包括seq id no：3或与seq id no：3具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％以上同源性的核苷酸序列。
13、所述的果糖-1,6-二磷酸酶来源于埃希氏菌属(escherichia)、弧菌属(vibrio)或酵母菌属(saccharomyces)中的一种或两种以上，优选的，所述的果糖-1,6-二磷酸酶来源于大肠杆菌(escherichia coli)、需钠弧菌(vibrio natriegens)或酿酒酵母(saccharomyces cerevisia本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程改造的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的盐单胞菌中引入非氧化糖酵解通路，和/或，所述的盐单胞菌中引入苹果酰辅酶A-甘油酸通路。
2.根据权利要求1所述的盐单胞菌，其特征在于，所述的盐单胞菌表达非氧化糖酵解通路的酶，和/或，所述的盐单胞菌表达苹果酰辅酶A-甘油酸通路的酶。
3.根据权利要求2所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的非氧化糖酵解通路的酶包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶、磷酸酮醇酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶、磷酸丙糖异构酶或果糖-1,6-二磷酸醛缩酶中的一种或两种以上。
4.根据权利要求2所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的苹果酰辅酶A-甘油酸通路的酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰-CoA裂解酶、乙醛酸聚醛酶、羟基丙二酸半醛还原酶、甘油酸激酶、烯醇化酶或乙醇酸脱氢酶中的一种或两种以上。
5.根据权利要求2所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的盐单胞菌(
6.根据权利要求5所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来源于埃希氏菌属(Escherichia)、明串珠菌属(Leuconostoc)或甲基菌属(Methylobacillus)中的一种或两种以上；所述的果糖-1,6-二磷酸酶来源于埃希氏菌属(Escherichia)、弧菌属(Vibrio)或酵母菌属(Saccharomyces)中的一种或两种以上；所述的磷酸酮醇酶来源于双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)或梭菌属(Clostridium)中的一种或两种以上。
7.根据权利要求5所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：9，所述的果糖-1,6-二磷酸酶的氨基酸序列包含SEQID NO：8，所述的磷酸酮醇酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：7。
8.根据权利要求5所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的苹果酸硫激酶来源于甲基球菌属(Methylococcus)；所述的苹果酰-CoA裂解酶来源于甲基杆菌属(Methylobacterium)；所述的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于埃希氏菌属(Escherichia)。
9.根据权利要求5所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的苹果酸硫激酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13中的一种或两种，所述的苹果酰-CoA裂解酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：11，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列包括SEQ IDNO：12。
10.根据权利要求1所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的盐单胞菌包含外源基因，所述的外源基因包括非氧化糖酵解通路的酶的编码基因，和/或，所述的外源基因包括苹果酰辅酶A-甘油酸通路的酶的编码基因；优选的，所述的外源基因包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因、果糖-1,6-二磷酸酶编码基因、磷酸酮醇酶编码基因、转醛醇酶编码基因、转酮醇酶编码基因、核酮糖-5-磷酸差向异构酶编码基因、核糖-5-磷酸异构酶编码基因、磷酸丙糖异构酶编码基因或果糖-1,6-二磷酸醛缩酶编码基因中的一种或两种以上，和/或，所述的外源基因包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因、苹果酸脱氢酶编码基因、苹果酸硫激酶编码基因、苹果酰-CoA裂解酶编码基因、乙醛酸聚醛酶编码基因、羟基丙二酸半醛还原酶编码基因、甘油酸激酶编码基因、烯醇化酶编码基因或乙醇酸脱氢酶编码基因中的一种或两种以上；进一步优选的，所述的外源基因包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因、果糖-1,6-二磷酸酶编码基因和磷酸酮醇酶编码基因，和/或，所述的外源基因包括苹果酸硫激酶编码基因、苹果酰-CoA裂解酶编码基因和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因。
11.根据权利要求10所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的外源基因在质粒上表达或在染色体上表达。
12.根据权利要求10所述的盐单胞菌(Halomonas)，其特征在于，所述的外源基因受启动子调控；所述的启动子包括组成型或诱导型启动子。
13.根据权利要求1所述的盐单胞菌(Halomonas)，其...
【技术特征摘要】
1.一种工程改造的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的盐单胞菌中引入非氧化糖酵解通路，和/或，所述的盐单胞菌中引入苹果酰辅酶a-甘油酸通路。
2.根据权利要求1所述的盐单胞菌，其特征在于，所述的盐单胞菌表达非氧化糖酵解通路的酶，和/或，所述的盐单胞菌表达苹果酰辅酶a-甘油酸通路的酶。
3.根据权利要求2所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的非氧化糖酵解通路的酶包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶、磷酸酮醇酶、转醛醇酶、转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶、磷酸丙糖异构酶或果糖-1,6-二磷酸醛缩酶中的一种或两种以上。
4.根据权利要求2所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的苹果酰辅酶a-甘油酸通路的酶包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸硫激酶、苹果酰-coa裂解酶、乙醛酸聚醛酶、羟基丙二酸半醛还原酶、甘油酸激酶、烯醇化酶或乙醇酸脱氢酶中的一种或两种以上。
5.根据权利要求2所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的盐单胞菌(halomonas)表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、果糖-1,6-二磷酸酶和磷酸酮醇酶，和/或，所述的盐单胞菌(halomonas)表达苹果酸硫激酶、苹果酰-coa裂解酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。
6.根据权利要求5所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶来源于埃希氏菌属(escherichia)、明串珠菌属(leuconostoc)或甲基菌属(methylobacillus)中的一种或两种以上；所述的果糖-1,6-二磷酸酶来源于埃希氏菌属(escherichia)、弧菌属(vibrio)或酵母菌属(saccharomyces)中的一种或两种以上；所述的磷酸酮醇酶来源于双歧杆菌属(bifidobacterium)、明串珠菌属(leuconostoc)或梭菌属(clostridium)中的一种或两种以上。
7.根据权利要求5所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的氨基酸序列包含seq id no：9，所述的果糖-1,6-二磷酸酶的氨基酸序列包含seqid no：8，所述的磷酸酮醇酶的氨基酸序列包含seq id no：7。
8.根据权利要求5所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的苹果酸硫激酶来源于甲基球菌属(methylococcus)；所述的苹果酰-coa裂解酶来源于甲基杆菌属(methylobacterium)；所述的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶来源于埃希氏菌属(escherichia)。
9.根据权利要求5所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的苹果酸硫激酶的氨基酸序列包含seq id no：10或seq id no：13中的一种或两种，所述的苹果酰-coa裂解酶的氨基酸序列包含seq id no：11，所述的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列包括seq idno：12。
10.根据权利要求1所述的盐单胞菌(halomonas)，其特征在于，所述的盐单胞菌包含外源基因，所述的外源基因包括非氧化糖酵解通路的酶的编码基因，和/或，所述的外源基因包括苹果酰辅酶a-甘油酸通路的酶的编码基因；优选的，所述的外源基因包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因、果糖-1,6-二磷酸酶编码基因、磷酸酮醇酶编码基因、转醛醇酶编码基因、转酮醇酶编码基因、核酮糖-5-磷酸差向异构酶编码基因、核糖-5-磷酸异构酶编码基因、磷酸丙糖异构酶编码基因或果糖-1,6-二磷酸醛缩酶编码基因中的一种或两种以上，和/或，所述的外源基因包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因、苹果酸脱氢酶编码基因、苹果酸硫激酶编码基因、苹果酰-coa裂解酶编码基因、乙醛酸聚醛酶编码基因、羟基丙二酸半醛还原酶编码基因、甘油酸激酶编码基因、烯醇化酶编码基因或乙醇酸脱氢酶编码基因中的一种或两种以上；进一步优选的，所述的外源基因包括6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因、果糖-1,6-二磷酸酶编码基因和磷酸酮醇酶编码基因，和/或，所述的外源基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，张忠楠，邵明威，张戈，刘絮，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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