基于制造技术

本发明专利技术公开了基于

【技术实现步骤摘要】
基于One
‑
Tube RPA
‑
CRISPR/Cas12a的腺病毒快速检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及基于
One
‑
Tube RPA
‑
CRISPR/Cas12a
的腺病毒快速检测方法
。

技术介绍

[0002]腺病毒
(adenovirus
，
AdV)
是一种无包膜的双链
DNA
病毒，人腺病毒
(human adenovirus
，
HAdV)
是哺乳动物
AdV
属中的一员，目前已经发现了7个亚群
(HAdV
‑
A
至
HAdV
‑
G)
，包含有
69
种血清型和
70
多个基因型
。
通常会引起上
、
下呼吸道，胃肠道和结膜等的轻度感染，症状严重时或特定情况下
(
免疫功能低下患者
)
会出现血性膀胱炎
、
肝炎
、
出血性结肠炎
、
胰腺炎
、
肾炎或脑炎，死亡率可能超过
50
％
。
由于缺乏体液免疫，幼儿是
HAdV
的感染多发年龄段，并且在封闭或拥挤环境中的健康儿童或成人
(
特别是新兵
>)
感染的概率更高
。
因此，在腺病毒感染的早期能够将其快速的诊断，是有效治疗患者
、
降低死亡率的重要手段
。
[0003]核酸检测技术因其特异性好
、
灵敏度高的优点越来越受到各大医院和诊断实验室的青睐
。
但是，基于聚合酶链式反应
(PCR)
原理的一系列核酸检测技术，受限制于变温控制模块，通常使得仪器庞大不便于携带至临床边和疫区现场，或又因其昂贵的设备价格难以普及至偏远地区
。
重组酶聚合酶扩增
(Recombinase polymerase amplification
，
RPA)
技术是由重组酶与聚合酶催化，在
37
～
42℃
的恒温条件下对靶标
DNA
特异片段进行扩增的一项技术，因其快速
、
简便
、
等温而成为现场诊断的首选扩增技术
。
此外，基于
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
‑
Cas(CRISPR associated)
系统中的
Cas12a
和
Cas13a
而开发的体外诊断技术
(DETECTR
和
SHERLOCK)
被证实能够有效的检测病原微生物，具有良好的特异性和可靠性
。
因为
Cas12a
‑
crRNA
能够识别单链或双链
DNA
，不需要将底物
DNA
转换成
RNA
而省去了转录步骤
。
因此，基于
RPA
前扩增的
CRISPR/Cas12a
技术用于
DNA
病毒的核酸检测操作会更加简便
。
[0004]传统的两步法
RPA
‑
CRISPR/Cas12a
检测技术包含前扩增子的转移和多种人工操作，使测试过程复杂化，在扩增产物的转移过程中有造成气溶胶污染的风险
。
而提前将靶标
DNA、RPA
试剂和
CRISPR
试剂加入一管的检测方法，可以减少二次开盖带来的气溶胶污染且对灵敏度没有影响，在恒定的温度下保持一段时间即可完成检测，更加方便快捷
。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何精准
、
灵敏
、
方便
、
快速地检测腺病毒
。
所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题
。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于检测腺病毒的引物对，所述引物对可为特异性扩增腺病毒检测靶标基因的一对引物，所述腺病毒检测靶标基因的核苷酸序列可为
SEQ ID No.1。
[0007]进一步地，所述引物对可由引物
Ade
‑
F1
和引物
Ade
‑
R4
组成，所述引物
Ade
‑
F1
可为
SEQ ID No.2
所示的单链
DNA
分子；所述引物
Ade
‑
R4
可为
SEQ ID No.9
所示的单链
DNA
分子
。
[0008]本专利技术还提供了用于检测腺病毒的组合物，所述组合物可包括所述引物对和
crRNA
，所述
crRNA
的序列可由锚定序列和向导序列组成，所述向导序列可为
SEQ ID No.12
的第
22
‑
45
位
。
[0009]上述组合物中，所述
crRNA
的核苷酸序列可为
SEQ ID No.12。
[0010]进一步地，所述组合物还可包括探针
(
名称为
exoRPA
‑
P)
，所述探针
exoRPA
‑
P
的核苷酸序列可为
SEQ ID No.10。
[0011]进一步地，所述探针
(SEQ ID No.10)
的第
31
位碱基
T
可标记
FAM
，第
33
位碱基
G
可用四氢呋喃
(THF)
取代，第
34
位碱基
T
可标记淬灭基团
BHQ1。
[0012]进一步地，所述探针
exoRPA
‑
P
的3’
端可标记
C3
‑
spacer。
[0013]上述组合物中，所述组合物还可包括
ssDNA
和
/
或
Cas12a
蛋白，所述
ssDN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于检测腺病毒的引物对，其特征在于，所述引物对为特异性扩增腺病毒检测靶标基因的一对引物，所述腺病毒检测靶标基因的核苷酸序列为
SEQ ID No.1。2.
根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对由引物
Ade
‑
F1
和引物
Ade
‑
R4
组成，所述引物
Ade
‑
F1
为
SEQ ID No.2
所示的单链
DNA
分子；所述引物
Ade
‑
R4
为
SEQ ID No.9
所示的单链
DNA
分子
。3.
用于检测腺病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1或2所述的引物对和
crRNA
，所述
crRNA
的序列由锚定序列和向导序列组成，所述向导序列为
SEQ ID No.12
的第
22
‑
45
位
。4.
根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述
crRNA
的核苷酸序列为
SEQ ID No.12。5.
根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括探针，所述探针的核苷酸序列为
SEQ ID No.10。6.
用于检测腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物对，或包括权利要求3‑5中任一所述的组合物
。7.
权利要求3或4中所述的
crRNA
或权...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁兵，袁媛，武雅蓉，徐健皓，王晓东，张益铜，王景林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：