一种免扩增的制造技术

本发明专利技术提供一种免扩增的

【技术实现步骤摘要】
一种免扩增的DNA病毒基因组滴度的测量方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种免扩增的
DNA
病毒基因组的滴度测量方法
。

技术介绍

[0002]病毒主要根据其基因组的性质和结构以及它们的复制方法进行分类，而并非根据它们所引起的疾病
。
因此，可分为
DNA
病毒和
RNA
病毒两大类
。
每种类型又可以根据其遗传物质是单链还是双链进一步分为两个子类
。
单链病毒又可以进一步分为正义链和反义链病毒
。DNA
病毒一般在宿主细胞核内复制，而
RNA
病毒通常在细胞质中复制
。
[0003]DNA
病毒是生物病毒的一种，属于一级病毒
。
常见的
DNA
病毒有双链
DNA
病毒
(dsDNA viruses)
，例如腺病毒
、
疱疹病毒
、
巨细胞病毒等；单链
DNA
病毒
(ssDNAviruses)
，例如小脱氧核糖核酸病毒
(parvoviruses)
，腺相关病毒
(AAV)
等
。
[0004]CRISPR/Cas
系统
(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR
‑
associatedprotein)
是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫防御机制
。
由细菌和古生菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来
。
该系统能够整合外援侵入宿主的
DNA
片段到
CRISPR
位点，然后通过相应的
CRISPRRNAs(crRNAs)
引导
Cas
核酸内切酶对外源
DNA
序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵
。
[0005]随着对
CRISPR
系统的深入挖掘，
Cas
蛋白的反式切割活性被发现，
Cas12a
蛋白又称
Cpf1
，被发现具有类似
Cas9
的
RuvC
内切酶结构域，但无
HNH
结构域，并且
Cas12a
的
N
‑
末端不具有
α
‑
螺旋识别叶，不需要
tracrRNA。
该系统作用时，由成熟的
crRNA
和
Cas12a
蛋白结合特异性识别富含
T
的
PAM
序列，切割形成粘性末端后进行修复
[YanFancheng,Wang William,ZhangJiaqiang.CRISPR
‑
Cas12 andCas13:thelesser
‑
knownsiblings ofCRISPR
‑
Cas9[J].Cell Biology andToxicology,2019,35(6):489
‑
492
；
YanWinston X,Hunnewell Pratyusha,Alfonse Lauren E,et al.Functionally diverse type V CRISPR
‑
Cas systems[J].Science,2018,363(6422):88
‑
91]。
研究表明，
Cas12a
蛋白比
Cas9
蛋白小，
crRNA
也接近
Cas9
的总
sgRNA
的一半，更容易进入细胞，实验效果更好
。
研究发现，
Cas12a
蛋白具有反式切割活性，
Cas12a
蛋白在
crRNA
的引导下特异性地与靶向双链
DNA(dsDNA)
结合并激活其反式切割活性，不加区别的切割非特异性单链
DNA(ssDNA)
，通过在
ssDNA
两端修饰荧光基团和猝灭基团，当
ssDNA
探针裂解后会发出荧光信号，即实现了荧光信号的累积与靶标检测的同步，从而实时监测反应进行
。
[0006]随着一段对
CRISPR
核酸内切酶如
Cas12a“反式切割”活性
(trans cleavage
，或称
collateral effect
，旁切活性
)
原理的解析，由此开辟出极具革命性的
CRISPR
检测新领域
。CN112980924
已经公开了一种利用
Cas12a“反式切割”活性免扩增测量
DNA
单分子的方法，然而，该方法涉及
dd
PCR
测定，对检测仪器的要求较高，很多研发人员在实际操作中鉴于条件上的缺失无法实现，因此，如何设计出更加简单
、
便捷，易于实现的免扩增病毒滴度测定方法，仍然是本领域亟待解决的问题
。
[0007]本文引用的所有文章和参考文献的内容通过引用整体并入本文
。

技术实现思路

[0008]本专利技术利用
Cas12
的目标序列特异结合后产生旁切活性的特点，专利技术了一种无需进行
PCR
指数放大就可以直接测试
DNA
病毒基因组滴度的新方法，规避了由指数放大和引物非特异性结合带来的系统性偏差和不稳定性，可以快捷
、
精确和稳定测定的滴度
。
[0009]在一方面，本专利技术提供一种免扩增的
DNA
病毒基因组的滴度测量方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010]S1:
制备不同摩尔浓度的标准品；
[0011]用质粒样品作为定量标准品，为了定量的批间稳定性，标准品以较低浓度
(
标曲定量最上限的
10
倍浓度
)
批量分装于特定的储存液中，置于
‑
80℃
保存防止样品降解
。
在一些实施方式中，标准品摩尔浓度的梯度可以依据情况设置为3个
、5
个
、6
个
、10
个或者更多，优选的，标准品摩尔浓度的梯度可以设置为7个
。
[0012]S2:
上述不同摩尔浓度的标准品与
crRNA、Ca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种免扩增的
DNA
病毒基因组滴度的测量方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:
制备不同摩尔浓度的
DNA
标准品；
S2:
所述不同摩尔浓度的
DNA
标准品分别与靶向所述
DNA
标准品中靶片段的
crRNA、Cas12
蛋白
、DNA
探针组成不同的
DNA
标准品
Cas12
反应体系；
S3:
测定所述不同的
Cas12
反应体系随时间变化的荧光信号，制备出不同的荧光累积曲线；
S4:
根据所述不同的荧光累积曲线得到不同的斜率；
S5:
根据所述
DNA
标准品摩尔浓度和所述斜率，得到表示它们之间关系的线性方程：
S6:
将包括
DNA
病毒基因组的待测样品与所述
crRNA、Cas12
蛋白和
DNA
探针组成待测样品
Cas12
反应体系，并检测所述待测样品反应体系随时间变化的荧光信号，制备出荧光累积曲线并得到待测样品斜率；
S7:
将所述待测样品斜率代入所述线性方程，得到所述待测样品中所述
DNA
病毒基因组的摩尔浓度，从而获得所述待测样品中
DNA
病毒基因组的滴度
。2.
据权利要求1所述的测量方法，其中，所述
DNA
探针为包括荧光基团和荧光淬灭基团的单链
DNA
探针
。3.
据权利要求1所述的测量方法，其中，所述
Cas12
蛋白为
FnCas12a、AsCas12a、enAsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a、Lb4Cas12a
和
Cas12b
中的一种或多种
。4.
根据权利要求1所述的测量方法，其中，所述
DNA
病毒为单链
DNA
病毒
。5.
根据权利要求4所述的测量方法，其中，所述单链
DNA
病毒为脱氧核糖核酸病毒
(parvoviruses)
，腺相关病毒
(AAV)、RA
‑1病毒
、
阿留申貂病病毒
、
貂肠炎病毒
、
小鼠小病毒
、
鸡贫血病毒
、
鹦鹉喙和羽毛病病毒，猪圆环病毒
、
指环病毒
(Anelloviridae)、
虹彩病毒
(Bacillariodnaviridae)、
二分
DNA
病毒
(Bidnaviridae)、
圆环病毒
(Circoviridae)、
双生病毒
(Geminiviridae)、
丝状噬菌体
(Inoviridae)、
微小噬菌体
(Microviridae)、
矮化病毒
(Nanoviridae)、
细小
DNA
病毒
(Parvoviridae)
和螺旋病毒
(Spiraviridae)
中的一种或多种
。6.
根据权利要求5所述的测量方法，其中，所述单链
DNA
病毒为腺相关病毒
(AAV)。7.
根据权利要求6所述的测量方法，其中，所述靶片段来自所述腺相关病毒基因组的
ITR
区
。8.
根据权利要求1所述的测量方法，其中，所述
DNA
病毒为双链
DNA
病毒
。9.
根据权利要求8所述的测量方法，其中，所述双链
DNA
病毒为疱疹病毒
、B
病毒
(

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，赵晟，李鹏，
申请(专利权)人：宜明苏州细胞生物科技有限公司济南宜明医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：