基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒

【技术实现步骤摘要】
基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒RNA及剪接体的引物和探针的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒
RNA
及剪接体的引物和探针的方法及其应用，属于乙型肝炎病毒检测

。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒
(Hepatitis B Virus,HBV)
感染是一个严峻的全球公共卫生问题，乙肝病毒感染分为急性和慢性感染，其中慢性感染可引起慢性乙型肝炎
(Chronic hepatitis B,CHB)、
肝硬化
(Liver cirrhosis,LC)
和原发性肝细胞癌
(Hepatocellulor carcinoma,HCC)
等相关疾病，严重危害人们健康
。
尽管现有的治疗药物如干扰素
(Interferon,IFN)
或核苷酸类似物
(Nucleos(t)ide analogues,NAs)
可以抑制病毒复制，减轻肝细胞炎症坏死及纤维化，延缓和减少肝硬化
、
肝癌及并发症的发生，但是均不能完全清除乙肝病毒共价闭合环状
DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)
，使得慢性乙型肝炎患者难以彻底治愈，同时患者需要长期用药，带来极大的经济负担
。
[0003]HBV cccDNA
是病毒微小染色体，是病毒
mRNA
转录的模板，
cccDNA
的持续存在是慢性乙型肝炎难以彻底治愈的根本原因，因此关闭
cccDNA
转录或失活为目标，达到功能性治愈
(HBsAg
清除
)
，不仅成为抗乙肝新药研发的关键靶点，也是临床可追求的治疗目标
。
但是目前临床功能性治愈指标上存在不足，急需改进和完善
。
作为理想的
HBV
检测指标，应该具备
1、
无创检测；
2、
能够反映
cccDNA
的含量或活性；
3、
在抗病毒治疗中，可作为停药的指针
。
[0004]最近研究报道表明血清中
HBV RNA
可反映慢性乙型肝炎患者肝内
cccDNA
的数量和转录活性，可作为慢性乙型肝炎患者功能治愈的一种理想检测靶标，国内外相关指南或共识也逐渐推荐采用血清
HBV RNA
这一新型病毒标志物来指导临床诊疗活动
。
血清中
HBV RNA
主要是
HBV
前基因组核糖核酸
(HBV pregenomic RNA
，
HBV pgRNA)
，
pgRNA
作为
cccDNA
转录的产物，能够较好地反映肝细胞内
cccDNA
的水平与转录活性
。
但血清中的
HBV
前基因组核糖核酸长度不一，既存在全长
pgRNA
，也存在
pgRNA
多种可变剪接体如
SP1(spliced variant1)
等
。
[0005]HBV RNA
的可变剪接是病毒复制过程中的重要事件，
cccDNA
转录成病毒
pgRNA
后，在宿主剪接因子的作用下发生可变剪接，5’
端同样带有
pgRNA
的装配信号，从而被装配到病毒颗粒中并分泌到细胞外
。
剪接体在肝脏疾病和干扰素抗病毒治疗应答中的重要作用，因此定量检测慢性乙型肝炎患者血清
HBV RNA
和剪接体水平具有非常重要的临床价值
。
[0006]现有检测慢性乙型肝炎患者血清
HBV RNA
的方法主要有基于普通荧光定量的检测方法，设计的引物探针区域不同，可能导致检测结果和研究结果不同
。
不足之处在于：
(1)
大部分采用单基因检测，由于
SP1
等剪接体的存在，可能导致现有检测方法存在漏检，出现假阴性；
(2)
检测方法是相对定量，主要根据参考品的标准曲线来进行相对定量，检测灵敏度不高
。
[0007]这几年，体外诊断技术发展迅猛，其中数字
PCR
技术
(droplet digital PCR
，
ddPCR)
比传统实时荧光定量
PCR
技术
(real
‑
time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)
具有更高的灵敏度和准确性，实现了核酸拷贝数的绝对定量
。
该技术根据泊松分布原理及阳性微滴的数量和比例，可直接检测待检靶分子的绝对数目，不依赖于标准曲线和
Ct
值，不受扩增效率影响，比实时荧光定量
PCR
技术具有更高的灵敏性，提高了核酸分子检测的灵敏性和准确性
。
[0008]最近在
HBV
复制
‑
转染细胞模型上检测到细胞内存在不同形式的
HBV RNA
剪接体，这些
HBV RNA
剪接体的存在会导致现有
HBV RNA
定量方法的不准确，导致假阴性
。
目前已报道
HBV RNA
的可变剪接体有
20
多种，但是临床慢乙肝患者血清中
HBV RNA
剪接体的种类和比例尚不清楚，因此无法实现对于
HBV RNA
以及剪接体高灵敏度的定量检测
。

技术实现思路

[0009]本专利技术是提供了一种基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒
RNA
及剪接体的引物和探针的方法，该引物和探针可同时实现对于
HBV RNA
以及剪接体高灵敏度的定量检测
。
[0010]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是，一种基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒
RNA
及剪接体的引物和探针的方法，利用
PacBio
单分子测序技术对慢乙肝患者血清
HBV RNA
及剪接体进行深度测序，通过构建的生信分析流程和策略，获得血清
HBV RNA
中剪接体的种类和比例；根据所获得的血清
HBV RNA
剪接体的种类和比例，进行特异性检测
HBV RNA
的引物与探针，以及特异性检测剪接体的引物与探针设计
。
[0011]进一步地，对特异性检测
HBV RNA<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于单分子测序设计检测乙型肝炎病毒
RNA
及剪接体的引物和探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用
PacBio
单分子测序技术对慢乙肝患者血清
HBV RNA
及剪接体进行深度测序，通过构建的生信分析流程和策略，获得血清
HBVRNA
中剪接体的种类和比例；根据所获得的血清
HBV RNA
剪接体的种类和比例，进行特异性检测
HBV RNA
的引物与探针，以及特异性检测剪接体的引物与探针设计
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于：对特异性检测
HBV RNA
的引物与探针的设计具体包括以下步骤：在血清
HBV RNA
的
HBc
和
HBx
蛋白核心区段设计引物与探针；所述引物位于血清
HBV RNA
的保守区段，同时避开
HBV RNA
常见剪切位点，以及占比
30
％以上的
HBV RNA
剪接体种类的剪切位点
。3.
如权利要求1所述的方法，其特征在于：对特异性检测剪接体的引物与探针设计具体包括以下步骤：针对占比最高的剪接体种类，在其
RNA
剪切位点附近设计引物和探针，其中反向引物位于所述
RNA
剪切位点区段内
。4.
一种用于乙型肝炎病毒
RNA
及剪接体检测的引物和探针组，其特征在于：包含两组用于乙型肝炎病毒
RNA
检测的引物和探针，以及一组用于剪接体检测的引物和探针，所述剪接体为
SP1
剪接体；其中一组用于乙型肝炎病毒
RNA
检测的引物为
HBV 2312FP
和
HBV 2413RP
，探针为
HBV 2359Probe
；所述
HBV 2312FP
的核酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述
HBV 2413RP
的核酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，所述
HBV 2359Probe
的核酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；另一组所述用于乙型肝炎病毒
RNA
检测的引物为
HBV 1528FP
和
HBV 1600RP
，探针为
HBV 1561Probe
；所述
HBV 1528FP
的核酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，所述

【专利技术属性】
技术研发人员：胡源，陈粤粤，黄爱龙，王梦春，刘雨欣，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：