一种用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及基因治疗技术领域，特别是涉及用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其新用途

【技术实现步骤摘要】
一种用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其用途


[0001]本专利技术涉及基因治疗
，特别是涉及用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及其用途
。

技术介绍

[0002]血小板凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分
。
这些因子的共同作用是维持在出血状态下正常的凝血生理功能
。
如果一种或多种凝血因子缺失，会导致一组遗传性出血性疾病
——
血友病
。
其中临床上最常见的
A
型血友病是一种由凝血因子
VIII
缺乏所引起的
X
连锁隐性遗传病
。
患者出现严重程度不等的凝血功能障碍及自发性出血
。
血友病
B
是凝血因子
Ⅸ
基因突变引起血浆
FIX
量的缺乏或质的缺陷所导致的一种
X
连锁隐性遗传性出血性疾病，在男性中的发病率约为
1/30000。
[0003]凝血因子替代疗法，作为目前血友病唯一的治疗手段，既包括早期的血浆衍生
(plasma
‑
derived,pd)
凝血因子，也包括由基因工程生产的重组人凝血因子蛋白产品
。
这些产品不仅价格昂贵，且长期应用会产生抑制因子
。
以
AAV
或者慢病毒载体作为递送手段的基因治疗通过将凝血因子蛋白编码基因永久性地整合到人体细胞中或长期植入到非分裂细胞中，可以起到由人体细胞自体持续表达具有完全功能的凝血因子的效果
。
因其可预见的长效性及安全性，基因治疗成为血友病治疗最具前景的治疗手段
。
[0004]近年来，在血友病临床应用上，
AAV
载体递送以肝脏为靶器官逐渐成为主流趋势，比如
BioMarin
的
BMN 270、UniQure
的
AMT
‑
061
等产品，均已开展至临床
III
期试验
。
然而这种技术路线无法避免药物产生肝脏毒性的风险
。2020
年
11
月
16
日，国际顶尖学术期刊
Nature
子刊
Nature Biotechnology
杂志发表了一篇题为：
A long
‑
term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells
的研究论文，该研究对患有
A
型血友病的狗进行的
AAV
病毒基因治疗试验，而在治疗后长达十年的观测中，研究团队发现
AAV
病毒携带的治疗性基因片段有些被整合到了狗的染色体上控制生长的基因附近，有诱发癌症的可能性
。
另外目前血友病
B
主要治疗方式还是凝血因子替代疗法，凝血因子经过血源
→
重组
→
长效的发展历程，但是患者需要终生用药，虽然这可在一定程度上控制疾病，但仍有出血风险，也给患者带来许多副作用和很大的经济负担
。
因此，全球有很多基因治疗公司试图以一次性方式，利用病毒载体递送
FIX
基因的功能性拷贝至患者体内，使肝脏表达缺失的凝血因子，从而消除患者的出血风险，达到治疗益处
。
目前临床上的几款基因治疗的药也已进展到临床阶段，如
Pfizer(Spark)
的
SPK
‑
9001
‑
LTFU101、Uniqure
的
AMT
‑
061
等，尤其是
Uniqure
的
AMT
‑
061
已进入到3期临床，在
2020
年
12
月
22
日，
uniQure
公司宣布暂停其治疗
B
型血友病的
III
期临床，原因是
AMT
‑
061
的临床实验中报告了一例肝癌患者病例
。
[0005]为避免肝脏毒性和肝癌隐患，血友病基因治疗必须探索更为安全且有效的
AAV
载体及给药方式，改变
AAV
药物在人体内的组织分布，使其成为一种具有显著安全性优势的基因治疗药物
。
而且现有的
AAV
递送至体内后表达的
FIX
量较小，不能满足治疗疾病所需的血
药浓度，因此同时需要开发能满足治疗疾病所需血药浓度的
AAV。

技术实现思路

[0006]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于遗传性凝血因子缺乏病治疗的核酸构建体及靶向肌肉的
AAV
载体血清型的新用途，用于解决现有技术中的问题
。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括以下元件：
[0008]编码凝血因子
IX
的多核苷酸；
[0009]AAV
顺式作用元件，所述
AAV
顺式作用元件包括
ITR、
启动子
、kozak
序列
、SV40 polyA、UTR
或
WPRE
中的一种或多种
。
[0010]优选的，所述编码凝血因子
IX
的多核苷酸序列为经过密码子优化的序列，优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸序列为包括
R338L
突变的凝血因子
IX
的序列；优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸的序列如
SEQ ID NO:23
所示或为与
SEQ ID NO:23
所示的序列具有
95
％相似性的序列
。
[0011]所述启动子选自哺乳动物组成型启动子
、
哺乳动物组织特异性启动子或哺乳动物诱导型启动子
。
[0012]所述核酸构建体的结构选自以下任一：
[0013]1)ITR
‑
启动子
‑
kozak
序列
‑
F9IDTM
基因表达框
‑
SV40 polyA
序列
‑
ITR
；
[0014]2)ITR
‑
启动子
‑
kozak
序列
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括以下元件：编码凝血因子
IX
的多核苷酸；
AAV
顺式作用元件，所述
AAV
顺式作用元件包括
ITR、
启动子
、kozak
序列
、SV40 polyA、UTR
或
WPRE
中的一种或多种
。2.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述编码凝血因子
IX
的多核苷酸序列为经过密码子优化的序列，优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸序列为包括
R338L
突变的凝血因子
IX
的序列；优选的，所述经过密码子优化的多核苷酸的序列如
SEQ ID NO:23
所示或为与
SEQ ID NO:23
所示的序列具有
95
％以上相似性的序列
。3.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述启动子选自哺乳动物组成型启动子
、
哺乳动物组织特异性启动子或哺乳动物诱导型启动子
。4.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述启动子选自肌肉组织特异性启动子；优选的，所述肌肉组织特异性启动子选自
tMCK、Desmin、SKCRM 4
‑
DES、tMCK2、CK8
或
MCK。5.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述
ITR
的长度为
130
～
145bp
；优选的，所述
ITR
的长度为
130bp、141bp
或
145bp
；更优选的，所述上游
ITR
和下游
ITR
的长度相同，均为
141bp。6.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的结构选自以下任一：
1)ITR
‑
启动子
‑
kozak
序列
‑
F9IDTM
基因表达框
‑
SV40 polyA
序列
‑
ITR
；
2)ITR
‑
启动子
‑
kozak
序列
‑
F9IDTM
基因表达框
‑
WPRE
‑
SV40 polyA
序列
‑
ITR
；
3)ITR
‑
启动子
‑
UTR
序列
‑
kozak
序列
‑
F9IDTM
基因表达框
‑
WPRE
‑
SV40 polyA
序列
‑
ITR。7.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为腺相关病毒载体
。8.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述腺相关病毒载体还包括载体骨架；优选的，所述载体骨架为
pAAV
‑
MCS
‑
ITR
‑
130
‑
CAG
‑
SV40
，核苷酸序列如
SEQ ID NO
：1所示
。9.
根据权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列选自以下任一：
SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21。10.
靶向肌肉组织的
AAV
载体血清型在制备遗传性凝血因子缺乏病治疗产品中的用途
。11.
根据权利要求
10
所述的用途，其特征在于，所述靶向肌肉的
AAV
载体血清型选自
AAV1、AAV2、AAV6、AAV6.2FF、AAV7、AAVrh74、AAV8、AAV9
或它们的突变体
。12.
根据权利要求
10
所述的用途，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊泉，苏玲玲，丁彦甫，傅晓斌，
申请(专利权)人：康霖生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：