用于基因治疗的核酸构建体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了用于基因治疗的核酸构建体及其用途，该核酸构建体编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段。本发明专利技术还提供了由所述核酸构建体制成的重组病毒例如重组腺相关病毒和重组慢病毒、以及所述核酸构建体和重组病毒在治疗高血脂性疾病中的用途。高血脂性疾病中的用途。高血脂性疾病中的用途。

【技术实现步骤摘要】
Aditya Goud, Abdelhai Abdelqader1,et al. PCSK9 inhibitors and their role in high
‑
risk patients in reducing LDL cholesterol levels: alirocumab. Future Cardiol. 2016 ;12(2):149
‑
57.)，导致患者需要每半个月左右注射一次药物。
[0007]因此，目前仍需开发出针对高血脂性疾病的新型药物，在保证良好的治疗效果的同时延长药效持续时间、避免对患者多次给药带来的不便。

技术实现思路

[0008]本专利技术依据阻断PCSK9与LDL
‑
R的结合可达到降低LDL
‑
C的原理，创造性地专利技术了用于治疗高血脂症的重组腺相关病毒(rAAV)载体和重组慢病毒载体，该载体携带编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的基因，可通过在体给药的方式使机体持续不断产生抗PCSK9抗体或其抗原结合片段，从而降低机体中的PCSK9含量，提高LDL
‑
R含量，达到降低LDL
‑
C含量的目的。
[0009]相应地，在第一方面，本专利技术提供了用于基因治疗的核酸构建体，其包含编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中所述编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列包含编码所述抗体的重链可变区的第一编码区和编码所述抗体的轻链可变区的第二编码区，并且所述第一编码区和所述第二编码区通过编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)连接。
[0010]在一些实施方案中，所述抗PCSK9抗体选自Alirocumab和Evolocumab。
[0011]在一些实施方案中，衍生自抗PCSK9抗体的抗原结合片段可以选自Fab、Fab
’
、F(ab
’
)2、Fv、scFv和ds
‑
scFv。
[0012]在一些实施方案中，核酸构建体包含的第一编码区编码抗PCSK9抗体的重链且所述第二编码区编码抗PCSK9抗体的轻链。在一些实施方案中，所述核酸构建体从5
’
端至3
’
端编码以下结构：(1) Alirocumab重链
‑
linker
‑
Alirocumab轻链；(2) Alirocumab轻链
‑
linker
‑
Alirocumab重链；(3) Evolocumab重链
‑
linker
‑
Evolocumab轻链；或(4) Evolocumab轻链
‑
linker
‑
Evolocumab重链；其中，linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)。
[0013]在一些实施方案中，Alirocumab重链包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO: 17具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本专利技术的核酸构建体中的编码Alirocumab重链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO: 19或21所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO: 19或21具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的核苷酸序列。
[0014]在一些实施方案中，Alirocumab轻链包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO: 18具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本专利技术的核酸构建体中的编码Alirocumab轻链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO: 20或22所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO: 20或22具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少
96%、至少98%或至少99%序列同一性的核苷酸序列。
[0015]在一些实施方案中，Evolocumab重链包含如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO: 23具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本专利技术的核酸构建体中的编码Evolocumab重链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO: 25或27所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO: 25或27具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的核苷酸序列。
[0016]在一些实施方案中，Evolocumab轻链包含如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO: 24具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本专利技术的核酸构建体中的编码Evolocumab轻链的核苷酸序列包含如SEQ ID NO: 26或28所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO: 26或28具有至少80%、至少85%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%或至少99%序列同一性的核苷酸序列。
[0017]2A肽是来源于病毒的短肽，能使一条转录产物翻译产生多条多肽链。2A肽通过使核糖体跳过2A元件C
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末端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游多肽链分离。由编码2A肽的核苷酸序列连接的两个蛋白质在翻译完成后，上游蛋白的C端将会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。
[0018]在一些实施方案中，连接第一编码区和第二编码区的核苷酸序列所编码的接头为2A肽类接头。在一些实施方案中，2A肽类接头包含选自以下的2A肽：口蹄疫病毒2A肽(F2A)、猪捷申病毒2A肽(P2A)、Thosea asign病毒2A肽(T2A)和马鼻炎病毒2A肽(E2A)。在一些优选的实施方案中，2A肽类接头包含选自SEQ ID NO: 30
‑
33中任一项所示的氨基酸序列。在一些更优选的实施方案中，2A肽类接头包含如SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列。
[0019]在一些实施方案中，所述第一编码区和第二编码区的5
’
端进一步包含编码信号肽的核苷酸序列，并且所述第一编码区和第二编码区编码的信号肽可以相同或不同。在一些优选的实施方案中，信号肽可以选自：SAP信号肽、IHC信号肽、ILC信号肽、AP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于基因治疗的核酸构建体，其包含编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，其中所述编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列包含编码所述抗体的重链可变区的第一编码区和编码所述抗体的轻链可变区的第二编码区，并且所述第一编码区和所述第二编码区通过编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)连接。2.权利要求1的核酸构建体，其中所述抗PCSK9抗体选自阿莫罗布单抗(Alirocumab)和依洛尤单抗(Evolocumab)。3.权利要求1的核酸构建体，其中所述抗原结合片段选自：Fab、Fab
’
、F(ab
’
)2、Fv、scFv和ds
‑
scFv。4.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一编码区编码所述抗体的重链且所述第二编码区编码所述抗体的轻链。5.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5
’
端至3
’
端编码以下结构：(1) Alirocumab重链
‑
linker
‑
Alirocumab轻链；(2) Alirocumab轻链
‑
linker
‑
Alirocumab重链；(3) Evolocumab重链
‑
linker
‑
Evolocumab轻链；或(4) Evolocumab轻链
‑
linker
‑
Evolocumab重链；其中，linker是编码接头的核苷酸序列或内部核糖体进入位点(IRES)。6. 权利要求5的核酸构建体，其中所述Alirocumab重链具有如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，所述Alirocumab轻链具有如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；和/或所述Evolocumab重链具有如SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列，所述Evolocumab轻链具有如SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列。7.权利要求1的核酸构建体，其中所述接头为2A肽类接头。8. 权利要求7的核酸构建体，其中所述2A肽类接头包含选自以下的2A肽：口蹄疫病毒2A肽(F2A)、猪捷申病毒2A肽(P2A)、Thosea asign病毒2A肽(T2A)和马鼻炎病毒2A肽(E2A)。9. 权利要求8的核酸构建体，其中所述2A肽类接头包含选自SEQ ID NO: 30
‑
33中任一项所示的氨基酸序列。10.权利要求1的核酸构建体，其中所述第一编码区和第二编码区的5
’
端进一步包含编码信号肽的核苷酸序列，并且所述第一编码区和第二编码区编码的信号肽可以相同或不同。11.权利要求10的核酸构建体，其中所述信号肽选自：SAP信号肽、IHC信号肽、ILC信号肽、AP信号肽、CSP信号肽、IL2信号肽、TPA信号肽、L1信号肽、H7信号肽、SP1信号肽和H1信号肽。12.权利要求11的核酸构建体，其中所述信号肽选自：IL2信号肽、TPA信号肽、SP1信号肽、H7信号肽、H1信号肽、CSP信号肽和L1信号肽。13. 权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO: 41
‑
51中任一项所示的核苷酸序列。14. 权利要求13的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO: 41或42所示的核苷酸序列。15.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含与所述编码抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列可操作连接的启动子。
16.权利要求15的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊泉，陈非飞，周浩，杨伟涛，
申请(专利权)人：康霖生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：