一种核酸构建体制造技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，特别是涉及一种核酸构建体，本发明专利技术的核酸构建体包括启动子，启动子选自组成型启动子或特异型启动子；所述核酸构建体还包括编码2a肽或类2a肽的多核苷酸；所述核酸构建体还包括编码酪氨酸羟化酶、gtp

【技术实现步骤摘要】
一种核酸构建体
[0001]本申请是申请日为2020年03月13日、申请号为202010174737.0、专利技术名称为“一种核酸构建体”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及医药
，特别是涉及一种核酸构建体。

技术介绍

[0003]帕金森病(parkinson's disease，pd)是一种常见的神经退行性疾病。pd患者以黑质区多巴胺能神经元丢失为特征。多巴胺能神经元主要是一类能产生多巴胺的神经元，能将神经冲动信号传递至纹状体，而纹状体主要控制骨骼肌的运动，因此多巴胺合成的减少导致了机体的运动障碍。患者的主要临床表现为：运动迟缓、肌强直、静止性震颤、姿势步态异常等。pd影响全球约1％的55岁以上的人群，随着社会步入老年化，患者群体还会持续扩大。
[0004]帕金森病的常见治疗方法是口服给药多巴胺的前体—左旋多巴，该药物在治疗早期病情缓解效果较好，但是随着治疗“蜜月期”的结束，左旋多巴会导致多种运动并发症。而多巴胺激动剂类药物虽能一定程度缓解症状，但长期使用会导致消化道反应和精神症状等不良反应。手术治疗虽能改善症状，但不能根治疾病，术后仍需应用药物治疗，也可能带来相关并发症，如舌头和手的麻痹、辨距不清和意识不清等症状，也存在一定局限性。
[0005]基因治疗对于帕金森病治疗具有独特优势，一方面是将相关基因通过载体导入病灶部位，对靶点区域的细胞进行修复、补偿和校正，以恢复相关区域正常生理功能。主要是通过导入神经营养因子〔包括胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、neurturin和脑源性神经营养因子(bdnf)〕促进和保护相关神经元的存活。但是，多数pd患者发病时大量的多巴胺神经元丢失，因此，通过提升患者相关神经核团对多巴胺的合成可能是治疗该疾病的关键。
[0006]同时，帕金森病的本质仍然是一种神经退行性疾病，pd患者黑质区多巴胺能神经元不可逆的丢失是帕金森病患者脑部病变的主要特征。如何既能有效的在神经细胞内提高多巴胺合成，又能够保护神经元不受到蛋白表达变化，以及多巴胺及其复杂的代谢物的影响，保持细胞活性，从而更长期稳定的产生多巴胺，是帕金森病基因治疗策略关注的主要问题之一。
[0007]英国的oxford biomedica和美国的axovant gene therapy联合开发的帕金森病基因治疗在研药axo
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lenti
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pd(oxb
‑
102)，目前处于临床i/ii期研究阶段，动物及临床试验数据证据证明该药可以有效的提高中脑纹状体的局部多巴胺，并且改善相关帕金森病症状，但长期药效学研究尚在调查中，且但数据显示，以axo
‑
lenti
‑
pd为基础的慢病毒载体在体外培养细胞中表现出明显的体外细胞毒性。

技术实现思路

[0008]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种核酸构建体，用于解
决现有技术中的问题。
[0009]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括启动子，所述启动子选自选自组成型启动子或特异型启动子；所述核酸构建体还包括编码2a肽或类2a肽的多核苷酸；所述核酸构建体还包括编码酪氨酸羟化酶(th)、gtp
‑
环化水解酶i(gch1)或芳香族氨基酸多巴脱羧酶(aadc)的多核苷酸中的两种或两种以上核苷酸，所述编码th、gch1或aadc的多核苷酸之间通过编码2a肽或类2a肽的多核苷酸连接。
[0010]所述核酸构建体包括编码th、gch1和aadc的多核苷酸。
[0011]所述核酸构建体的结构为依次编码以下酶或多肽的多核苷酸aadc—2a肽或类2a肽—gch1—2a肽或类2a肽—th。
[0012]所述2a肽或类2a肽可以为源于口蹄疫病毒的2a肽(f2a)、源于猪捷申病毒的2a肽(p2a)、源于昆虫病毒的2a肽(t2a)，以及源于马鼻炎病毒的2a肽(e2a)。
[0013]优选的，所述组成型启动子选自cmv启动子；所述特异型启动子选自嵌合型synapsin i启动子(chimeric synapsin i promoter,csp)启动子或3
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磷酸甘油酸激酶基因(human phosphoglycerate kinase,pgk)启动子。
[0014]优选的，所述核酸构建体为病毒载体。
[0015]优选的，所述病毒载体为慢病毒载体或腺相关病毒载体，，所述启动子、编码2a肽或类2a肽的多核苷酸、编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶、编码gtp
‑
环化水解酶i或编码酪氨酸羟化酶的多核苷酸位于所述慢病毒载体或腺相关病毒载体的表达框中。
[0016]优选的，所述慢病毒载体骨架为pkl
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amp
‑
cmv，所述慢病毒载体骨架的核苷酸序列如seq id no:01。
[0017]本专利技术第二方面提供一种慢病毒，所述慢病毒由所述核酸构建体经病毒包装而成。
[0018]本专利技术第三方面提供一种慢病毒载体系统，其特征在于，所述慢病毒载体系统包括所述的核酸构建体以及辅助质粒。
[0019]优选的，所述慢病毒载体系统还包括宿主细胞。
[0020]本专利技术第四方面提供一种用于预防或治疗帕金森病的组合物，其有效物质含有：所述核酸构建体；和/或所述慢病毒。
[0021]本专利技术第五方面提供一种细胞系，所述细胞系为经所述慢病毒感染后，能表达th、gch1、aadc的细胞系。
[0022]本专利技术第六方面提供所述核酸构建体、慢病毒、慢病毒载体系统、组合物、细胞系在制备预防、治疗神经退行性疾病的药物中的用途。
[0023]所述神经退行性疾病包括原发性帕金森病、不典型帕金森综合征、帕金森叠加综合征、继发性帕金森综合征或特发性震颤中的一种。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0025]1)利用2a肽连接各蛋白，使本专利技术的核酸构建体在单位多巴胺表达量较高的情况下，细胞毒性比现有在研药的核酸构建体显著降低。
[0026]2)本专利技术的核酸构建体中，采用csp或pgk弱启动子的构建体表现出非常弱或几乎完全没有的细胞毒性。
[0027]3)为神经退行性疾病的预防、治疗提供新的策略。
附图说明
[0028]图1显示为本专利技术的慢病毒载体设计
[0029]图2显示为pkl
‑
amp
‑
cmv质粒图谱。
[0030]图3显示为sh
‑
sy5y细胞感染慢病毒载体后细胞活性统计图。
具体实施方式
[0031]术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体可以为慢病毒载体，慢病毒载体包括载体骨架即空载体与表达框架。
[0032]术语“载体”是指用于将一个或多个核酸或一个或多个多核苷酸引入或转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物，其特征在于，包括以下元件：(a)启动子序列，所述启动子为CSP启动子或pgk启动子；(b)一个或多个编码2a肽或类2a肽的多核苷酸；(c)芳香族氨基酸多巴脱羧酶的编码序列；(d)gtp
‑
环化水解酶i的编码序列；(e)酪氨酸羟化酶的编码序列。2.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，具有从5
’‑3’
的式I结构：P1
‑
X1
‑
Z1
‑
X2
‑
Z2
‑
X3(I)；其中，P1为启动子序列，所述启动子为CSP启动子或pgk启动子；X1为芳香族氨基酸多巴脱羧酶的编码序列；Z1为任选的编码2a肽或类2a肽的多核苷酸；X2为gtp
‑
环化水解酶i的编码序列；Z2为任选的编码2a肽或类2a肽的多核苷酸；X3为酪氨酸羟化酶的编码序列。3.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述CSP启动子的序列如SEQ ID NO.6所示。4.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述pgk启动子的序列如SEQ ID NO.8所示。5.如权利要求1所述的核酸构建物，其特征在于，所述2a肽或...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊泉，党颖，苏玲玲，叶青，
申请(专利权)人：康霖生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：