【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因治疗。具体涉及用于年龄相关性黄斑变性(amd)例如湿性amd的核酸构建体。
技术介绍
1、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，amd)，也称为年龄相关的黄斑变性，是一种与年龄相关的、进行性、不可逆性中心视力丧失的疾病，是全球60岁以上老年人致盲的主要原因。晚期amd在临床上主要分为两大类：干性和湿性。其中干性amd以脉络膜下玻璃膜疣沉积和形成地图状萎缩为主要特点。湿性amd以脉络膜新生血管化(choroidal neovascularization,cnv)、视网膜下腔渗出为特征。新生血管性amd(neovascular amd,namd)，仅占amd总数的10％，但其致盲患者数占amd致盲总人数的90％。
2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)是调控血管生成和血管渗漏的关键因子，在脉络膜新生血管形成过程中有着重要作用。vegf属于血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)超家族中的成员。vegf家族成员包括vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d及胎盘样生长因子(placental-like growth factor，plgf)。其中，vegf-a与其受体vegfr-2结合后促使下游大量蛋白活化，导致血管内皮细胞生长、分化和增生，血管通透性增加。此外，vegf-a也是重要的炎性细胞趋化因子。目前vegf的病理性表达已经被
3、大量临床试验和实践证明玻璃体腔内注射抗vegf药物能够有效稳定和改善患者视力，短期疗效显著，成为namd患者的一线治疗方案。目前的抗vegf治疗药物包括雷珠单抗(ranibizumab；genentech，inc.)、eylea(aflibercept；regeneron pharmaceuticals，inc.)、beovu(brolucizumab；novartis，inc.)以及康柏西普(conbercept；成都康弘生物科技有限公司)等。
4、但抗vegf治疗仍存在一些实际的局限性，包括药物的高成本、需要频繁的玻璃体内注射、可能发生并发症、不完全应答和/或某些患者无法维持应答。因此，寻找更有效、更持久的治疗方法，对减少社会和个人的治疗负担有着重要作用。
5、此外，目前市售的或处于临床实验阶段的抗vegf药物大多以1:1甚至2:1的比率结合vegf，其治疗效果有限。因此，亟待开发一种能够以更高的结合比例结合vegf的抗vegf的更持久的药物。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、为解决上述问题，本专利技术通过在同一表达载体中包含编码融合的多种抗vegf分子的核苷酸序列，然后将包含该表达载体的病毒颗粒转导到人视觉细胞中，从而在视觉细胞中持续表达高水平的抗vegf分子。本专利技术的技术方案能够更高效的阻断vegf/vegfr的结合，从而有效地治疗年龄相关的黄斑变性。
2、相应地，在第一方面，本专利技术提供了一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含一种或多种编码vegf结合区的核苷酸序列，例如编码第一vegf结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二vegf结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一vegf结合区和/或第二vegf结合区各自独立地选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段和衍生自vegf受体(vegfr)的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的结构域2和结构域3(d2/3)。
3、本专利技术还提供了一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含编码第一vegf结合区的第一核苷酸序列和编码第二vegf结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一vegf结合区和第二vegf结合区各自独立地选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段和衍生自vegf受体(vegfr)的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的结构域2和结构域3(d2/3)。
4、在一些实施方案中，衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段可以选自scfv、fab、fab’、f(ab')2、fd、fd’、fv、ds-scfv和dab。
5、在一些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列连接。
6、在一些实施方案中，所述第一vegf结合区为衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，且所述第二vegf结合区为衍生自另一不同的抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)。
7、在一些实施方案中，所述第一vegf结合区为衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，且所述第二vegf结合区为衍生自vegfr的vegf结合片段。
8、在上述核酸构建体的一些实施方案中，所述核酸构建体还包含编码第三vegf结合区的第三核苷酸序列，所述第三vegf结合区选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)和/或衍生自vegfr的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3。
9、在一些优选的实施方案中，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列之间通过编码接头的核苷酸序列连接。
10、在一些实施方案中，所述第一vegf结合区为衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，所述第二vegf结合区为衍生自另一不同的抗vegf抗体的抗原结合片段(例如scfv)，且所述第三vegf结合区为衍生自vegfr的vegf结合片段。
11、在一些实施方案中，本专利技术的核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
12、(1)scfv1；
13、(2)d2/3；
14、(3)d2/3-linker-scfv1；
15、(4)scfv1-linker-scfv2；
16、(5)scfv1-linker-d2/3；
17、(6)scfv1-linker-scfv2-linker-d2/3；
18、(7)scfv1-linker-d2/3-linker-scfv2；或
19、(8)d2/3-linker-scfv1-linker-scfv2，
20、其中，scfv1是编码衍生自抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，scfv2是编码衍生自另一不同的抗vegf抗体的scfv的核苷酸序列，d2/3是编码衍生自vegfr的vegf结合片段的核苷酸序列，所述vegf结合片段包含vegfr的d2/3，linker是编码接头的核苷酸序列，其中每个接头可以相同或不同。
21、在一些实施方案中，本专利技术的核酸构建体还可以包含编码抗体的fc区的核苷酸序列。
22、在一些实施方案中，所述fc区可以是选自以下抗体同种型的fc区：iga、igg、igm、igd和ige。在一些实施方案中，所述fc区本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含一种或多种编码VEGF结合区的核苷酸序列，例如编码第一VEGF结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二VEGF结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一VEGF结合区和/或第二VEGF结合区各自独立地选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段例如scFv和衍生自VEGF受体(VEGFR)的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的结构域2和结构域3(D2/3)，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列连接。
2.权利要求1的核酸构建体，其中：
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码第三VEGF结合区的第三核苷酸序列，所述第三VEGF结合区选自衍生自抗VEGF抗体的抗原结合片段和/或衍生自VEGFR的VEGF结合片段，所述VEGF结合片段包含VEGFR的结构域2和结构域3(D2/3)，其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列之间通过编码接头的核苷酸序列连接。
4.权利要求3的核酸构建体，其中：
5.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，
6.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码抗体的Fc区的核苷酸序列，优选所述Fc区为人IgG1的Fc区。
7.权利要求6的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
8.权利要求1-7中任一项所述的核酸构建体，其中所述抗VEGF抗体选自Brolucizumab，Ranibizumab或Aflibercept；
9.权利要求8的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
10.权利要求1-9中任一项的权利要求，其中所述衍生自VEGFR的VEGF结合片段具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的核酸构建体，其中所述接头为不可切割的接头。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述接头各自独立地为(G1S)n，(G2S)n，(G3S)n或(G4S)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。
13.权利要求1-12中任一项的核酸构建体，其在所述编码序列的5’端进一步包含编码N端信号序列的核苷酸序列，
14.权利要求1-13中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含选自SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
16.权利要求1-15中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含启动子序列，用于所述核苷酸序列的表达，优选所述启动子为CAGG启动子。
17.权利要求1-16中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体为病毒载体。
18.权利要求17的核酸构建体，其中所述核酸构建体为慢病毒载体。
19.权利要求18所述的核酸构建体，其中所述慢病毒载体还包含选自嵌合型LTR启动子、HIV-1包装信号(ψ)、中心聚嘌呤区(cPPT)、Rev应答元件(RRE)、多嘌呤片段(PPT)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)、SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40 pAsignal)、SV40病毒的复制起始位点(SV40 ori)和自失活长末端重复序列的一个或多个元件。
20.权利要求17的核酸构建体，其中所述核酸构建体为腺相关病毒载体。
21.根据权利要求20所述的核酸构建体，其中所述腺相关病毒载体还包含选自SV40病毒的多腺苷酸化信号(SV40SL)、土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(WPRE)和反向末端重复序列(ITR)的一个或多个元件。
22.一种病毒颗粒，其包含权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体，优选所述病毒颗粒是慢病毒颗粒或腺相关病毒颗粒。
23.细胞，所述细胞包含根据权利要求1-21中任一项所述的核酸构建体。
24.权利要求23的细胞，其中所述核酸构建体是腺相关病毒载体，所述细胞还包含用于将所述...
【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体例如表达载体，所述核酸构建体包含一种或多种编码vegf结合区的核苷酸序列，例如编码第一vegf结合区的第一核苷酸序列和/或编码第二vegf结合区的第二核苷酸序列，其中所述第一vegf结合区和/或第二vegf结合区各自独立地选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段例如scfv和衍生自vegf受体(vegfr)的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的结构域2和结构域3(d2/3)，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列通过编码接头的核苷酸序列连接。
2.权利要求1的核酸构建体，其中：
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码第三vegf结合区的第三核苷酸序列，所述第三vegf结合区选自衍生自抗vegf抗体的抗原结合片段和/或衍生自vegfr的vegf结合片段，所述vegf结合片段包含vegfr的结构域2和结构域3(d2/3)，其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列之间通过编码接头的核苷酸序列连接。
4.权利要求3的核酸构建体，其中：
5.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
6.权利要求1-4中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含编码抗体的fc区的核苷酸序列，优选所述fc区为人igg1的fc区。
7.权利要求6的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
8.权利要求1-7中任一项所述的核酸构建体，其中所述抗vegf抗体选自brolucizumab，ranibizumab或aflibercept；
9.权利要求8的核酸构建体，其中所述核酸构建体从5’端至3’端包含以下结构：
10.权利要求1-9中任一项的权利要求，其中所述衍生自vegfr的vegf结合片段具有如seq id no:5所示的氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的核酸构建体，其中所述接头为不可切割的接头。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述接头各自独立地为(g1s)n，(g2s)n，(g3s)n或(g4s)n，其中n为1-10，优选n为2-8，更优选n为4或5。
13.权利要求1-12中任一项的核酸构建体，其在所述编码序列的5’端进一步包含编码n端信号序列的核苷酸序列，
14.权利要求1-13中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体编码融合蛋白，所述融合蛋白包含选自seq id no:13、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seqid no:15、seq id no:17、seq id no:19和seq id no:21的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含选自seq idno:14、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20和seq id no:22的核苷酸序列。
16.权利要求1-15中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体还包含启动子序列，用于所述核苷酸序列的表达，优选所述启动子为cagg启动子。
17.权利要求1-16中任一项的核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴昊泉，苏玲玲，陈梦娇，
申请(专利权)人：康霖生物科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。