【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体是涉及一种体外高效制备环状rna的方法。
技术介绍
1、环状rna(circular rna，circrna)是一类新兴的rna分子，具有不同于线性rna的分子形式，首尾通过3’羟基和5’磷酸的脱水缩合反应形成的磷酸二酯键相连。因为circrna的闭环结构使其降解需要更复杂和长程的调控，所以相较于线性rna分子，circrna在细胞内具有更强的稳定性。另外，研究发现装载内部核糖体进入元件(internal ribosomeentry site，ires)和编码区(coding sequence，cds)的circrna可以发挥信使rna(messenger rna，mrna)的功能。正基于此，circrna被认为可以成为mrna 2.0，从而进一步提升rna药物平台的发展潜力，拓宽rna药物的使用范围。
2、但是，circrna在成为mrna 2.0之前还有很长的探索路程，尤其是如何提高circrna体外环化的效率这一方面还存在较大空间。目前主流的rna环化分为“一步法”和“两步法”，基本流程相似：1)质粒线性化；2)体外转录(in vitro transcription，ivt)；3)rna环化；4)纯化。二者之间的区别在于ivt后是否进行产物纯化后再进行环化。这两种方法各有优劣：现有“两步法”的优势在于环化效率高(最高可达90％)，劣势在于ivt后需要进行纯化回收，rna有折损，且成本相对较高；现有“一步法”的优势则是成本低，rna回收率高，而劣势则是需要更长时间(一般在常规ivt所需时间
技术实现思路
1、基于现有环化方法存在的缺陷，本专利技术的目的提供了一种相较于“一步法”更快速、环化率更高，相较于“两步法”成本更低、回收率更高的circrna制备方法。
2、实现上述目的的技术方案包括如下。
3、一种circrna制备方法，包括以下步骤：
4、s1、构建具有自剪接活性的环化骨架序列，从5’至3’包含以下模块化元件：5’末端同源片段、3’内含子-外显子片段、5’内部同源片段、目标片段、3’内部同源片段、5’内含子-外显子片段、3’末端同源片段；
5、s2、将所述环化骨架序列合成后插入到载体质粒中进行扩增；
6、s3、制备线性化质粒；
7、s4、制备线性rna，获得ivt反应产物；
8、s5、制备环状rna：(1)配置环化反应体系，其中包含s3所述ivt反应物以及环化反应溶液；所述环化反应溶液为1×transcription buffer或无酶水，所述ivt反应物与环化反应溶液的体积比为9-1：1-9；
9、(2)将环化反应体系于30℃-60℃反应20分钟～60分钟；
10、(3)去除dna模板；
11、(4)纯化回收环状rna。
12、在一些实施例中，所述环化反应体系中包括所有酶的蛋白的量为2.83-0.28μg/μl。
13、在一些实施例中，所述ivt反应物与环化反应溶液的体积比为9-1：1-9，包括9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9，对应反应体系中蛋白(包括ivt反应中所有酶的总量)浓度分别为2.55μg/μl、2.26μg/μl、1.98μg/μl、1.70μg/μl、1.42μg/μl、1.13μg/μl、0.85μg/μl、0.57μg/μl、0.28μg/μl。
14、在一些实施例中，所述环化反应溶液为1×transcription buffer，所述ivt反应物与环化反应溶液的体积比为4-6：6-4，优选为包括4：6、5：5、6：4。
15、在一些实施例中，所述环化反应溶液为无酶水，所述ivt反应物与环化反应溶液的体积比为7-3：3-7，优选为包括7：3、6：4、5：5。
16、在一些实施例中，所述蛋白浓度为0.85μg/μl-1.98μg/μl，更优选为所述蛋白浓度为1.13μg/μl-1.70μg/μl。
17、在一些实施例中，所述环化反应溶液为1×transcription buffer时，所述环化反应溶液添加mgcl2和gtp，添加的mgcl2在反应体系中的浓度为20-60mm，添加的gtp在反应体系中的浓度为1-5mm。
18、在一些实施例中，添加的mgcl2在反应体系中的终浓度为30-50mm，更优选为38-42mm。
19、在一些实施例中，添加的gtp在反应体系中的的终浓度为1-5mm，优选为2-5mm，更优选为2.0-3.5mm。
20、在一些实施例中，所述反应温度为50℃-60℃，更优选为53-56℃。
21、在一些实施例中，所述反应时间为20分钟～60分钟，更优选为20分钟～50分钟。
22、在一些实施例中，在dna模板去除中，向所述环化体系中加入dnase i，于37℃条件下反应15分钟。
23、在一些实施例中，在制备线性rna中：(1)配置ivt反应体系：线性化质粒0.5μg，t7rna polymerase mix 2μl，10×transcription buffer 2μl，atp(100mm)2μl，utp(100mm)2μl，ctp(100mm)2μl，gtp(100mm)2μl，rnase inhibitor 1μl，最后用无酶水补齐至20μl；(2)将ivt反应体系于37℃条件下反应2小时即得。
24、在一些实施例中，所述环化骨架序列中所述5’末端同源片段和3’末端同源片段为人工设计的碱基互补配对元件，含20个核苷酸，具体序列为seq id no.1，seq id no.7。
25、在一些实施例中，所述5’内部同源片段和3’内部同源片段为人工设计的非完全碱基互补配对元件，含19-21个核苷酸，在其中一些优选的实施例中，具体序列为seq idno.3，seq id no.5。
26、所述3’内含子-外显子片段和5’内含子-外显子片段分别为group i型自剪接核酶在合适位置一分为二所得序列，所述group i型自剪接核酶为鱼腥藻来源的亮氨酸转移核糖核酸(transfer rna，trna)内含子、t4噬菌体来源的胸苷酸合成酶(thymidylatesynthase)内含子，所述合适位置选自group i型自剪接核酶第6结构域loop区；所述目标片段为蛋白编码或非编码序列。本专利技术所用序列为egfp荧光蛋白编码序列举例。
27、在研究中专利技术人发现，ivt反应中的一些成分会成为环化反应的干扰因素，特别是体系中蛋白(更多是酶)的含量，对环化效率等具有较大的影响，因此，环化的时候需要降低这些干扰因素的影响。本专利技术通过设置合适的环化反应体积与体外转录体积放大比例，通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种circRNA制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应体系中包括所有酶的蛋白的量为小于等于1.98μg/μL，优选为所述蛋白浓度为0.85μg/μL-1.98μg/μL，更优选为所述蛋白浓度为1.13μg/μL-1.70μg/μL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应溶液为1×Transcription buffer，所述IVT反应物与环化反应溶液的体积比为4-6：6-4，优选为包括4：6、5：5、6：4；或
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应溶液为1×Transcriptionbuffer，所述环化反应溶液中添加MgCl2和GTP，添加的MgCl2在反应体系中的浓度为10-60mM，添加的GTP在反应体系中的浓度为1-5mM。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述添加的MgCl2浓度为30-50mM，更优选为38-42mM。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述添加的GTP的浓度为
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为50℃-60℃，更优选为53-56℃；和/或所述反应时间为20分钟～50分钟。
8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述环化骨架序列中所述5’末端同源片段和3’末端同源片段为人工设计的碱基互补配对元件，分别为SEQ ID NO.1，SEQID NO.7。
9.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述5’内部同源片段和3’内部同源片段为人工设计的碱基互补配对元件，优选为序列SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5。
10.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述3’内含子-外显子片段和5’内含子-外显子片段分别为Group I型自剪接核酶在合适位置一分为二所得序列，所述合适位置选自Group I型自剪接核酶第6结构域loop区。
...【技术特征摘要】
1.一种circrna制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应体系中包括所有酶的蛋白的量为小于等于1.98μg/μl，优选为所述蛋白浓度为0.85μg/μl-1.98μg/μl，更优选为所述蛋白浓度为1.13μg/μl-1.70μg/μl。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应溶液为1×transcription buffer，所述ivt反应物与环化反应溶液的体积比为4-6：6-4，优选为包括4：6、5：5、6：4；或
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环化反应溶液为1×transcriptionbuffer，所述环化反应溶液中添加mgcl2和gtp，添加的mgcl2在反应体系中的浓度为10-60mm，添加的gtp在反应体系中的浓度为1-5mm。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述添加的mgcl2浓度为30-50mm，更优选为38-42mm。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵钊，郭世超，李建立，朱朝健，万季，潘有东，王弈，
申请(专利权)人：北京新合睿恩生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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