一种过表达/敲低GPR37基因的方法及其在食管鳞癌细胞放射敏感性影响中的应用技术

本发明专利技术提供了一种过表达/敲低GPR37基因的方法及其在食管鳞癌细胞放射敏感性影响中的应用，属于生物医学技术领域，提供了GPR37基因在食管鳞癌细胞放射敏感性中的重要作用。本发明专利技术首先建立稳定过表达GPR37食管鳞癌细胞系，通过细胞凋亡实验证实了过表达GRP37可以抑制食管鳞癌细胞的凋亡能力，得出过表达GPR37增强放射敏感性；然后建立稳定敲低GPR37食管鳞癌细胞系，通过细胞凋亡实验证实敲低GRP37促进食管鳞癌细胞凋亡能力，得出敲低GPR37抑制放射敏感性。因此本发明专利技术提供了构建GPR37过表达及敲低的方法，以及为食管鳞癌患者个体化治疗及实施更加有效的干预、治疗和预后判断方案提供参考，因此具有良好的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种过表达/敲低GPR37基因的方法及其在食管鳞癌细胞放射敏感性影响中的应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种过表达/敲低GPR37基因的方法及其在食管鳞癌细胞放射敏感性影响中的应用。

技术介绍

[0002]食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，在全球的发病率和死亡率位居第九和第六，虽然近年来长期生存率已显著提高，但总体预后仍然较差。我国是食管癌的高发病区，全球每年新发食管癌病例及死亡病例一半以上都在中国，其发病率和死亡率分别位列中国恶性肿瘤的第六位和第四位。它主要有两个亚型：食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)，我国90％以上食管癌病理类型为鳞癌，由于食管癌早期症状不明显，大多数患者就诊时已为中晚期，手术无法切除，此时根治性放化疗是其标准治疗手段，但该病5年生存率仍仅在20％左右，而放疗的耐受是其生存率低的主要原因之一，因此研究食管癌放疗的疗效预测分子指标非常的重要和迫切。
[0003]放疗目前是食管癌常见的治疗方法。目前，针对食管鳞癌放疗抵抗的研究仍较为缺乏，放疗增敏靶点较少。若放疗效果不佳而持续放疗，一方面，会增加患者的身体负担，使患者承受不必要的放疗副作用；另一方面，还可能导致错过其他有效的治疗策略，对患者生存期不利。放疗是通过电子辐射损伤肿瘤细胞，其原理是直接造成DNA双链断裂从而达到杀死肿瘤细胞的目的。然而随着病程的进展，肿瘤细胞不可避免的会出现放疗耐受性。对放疗敏感的肿瘤细胞在治疗早期已被清除，但放疗耐受的肿瘤细胞在相同治疗剂量下依旧能存活并持续增殖从而导致肿瘤复发。因此研究食管癌的放疗敏感性对进一步更彻底的治疗食管癌非常的重要且迫切。
[0004]VGPR37是脊椎动物G蛋白偶联受体37，也称为帕金相关内皮素样受体(PaelR)。GPR37主要在哺乳动物中枢神经系统中表达，其生物学功能有待进一步的研究。G蛋白偶联受体(GPCR)是最大的细胞表面受体家族，可以将细胞外环境的信号转导至细胞内并调节多种生理和疾病过程。已发现多种GPCR在癌症的发展和进程中起着至关重要的作用。我们通过TCGA数据库分析得知GPR37在食管癌肿瘤组织中的表达低于正常组织。在食管癌患者中，低表达的GPR37的患者总体生存率差，与肿瘤的T分期和N分期正相关，这表明GPR37在食管癌中可能发挥着抑癌基因的作用。目前GPR37在肿瘤中的研究并不十分广泛，有研究报道称GPR37低表达与肝癌的发生发展和预后有关，且参与肺癌的发展。因此推断，在食管癌细胞中GPR37可能参与了肿瘤的增殖、转移和不良预后等过程。
[0005]结合前期的大量文献调查和预实验结果，我们有理由推断GPR37影响食管鳞癌的发生发展过程以及放射敏感性，我们通过构建稳定敲低和过表达食管鳞癌细胞系等方法以此评估GPR37作为食管鳞癌放射敏感性的标志物，为患者实施个体化治疗，为食管鳞癌临床诊治提供一定的理论依据。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种过表达/敲低GPR37基因的方法及其在食管鳞癌细胞放射敏感性影响中的应用，用以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：
[0008]一种过表达/敲低GPR37基因的方法，包括如下步骤：
[0009]将GPR37基因稳定敲低及稳定过表达人GPR37基因质粒转染人食管鳞癌细胞，通过嘌呤霉素筛选，最终得到稳定敲低和稳定过表达GPR37基因的人食管鳞癌细胞。
[0010]进一步的，稳定敲低人GPR37基因的方法包括如下步骤：
[0011]S1：设计shRNA oligo，退火使两条oligo成双链；
[0012]S2：将PLKO载体用EcoRI和AgeI双酶切形成线性化PLKO.1载体；
[0013]S3：将上述退火后的oligo和载体连接；
[0014]S4：转化涂板单克隆鉴定；
[0015]S5：包装敲低GPR37慢病毒；
[0016]S6：在感染敲低病毒的人食管鳞癌细胞中加入嘌呤霉素，进行筛选，构建稳定转染细胞株。
[0017]进一步的，稳定过表达GPR37基因的方法包括如下步骤：
[0018]步骤1：扩增人GPR37基因；
[0019]步骤2：对Psin
‑
flag载体中的限制性酶切位点mlμI和speI进行酶切，形成线性化Psin
‑
flag载体；
[0020]步骤3：将步骤1和步骤2产物进行连接构建Psin
‑
flag
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GPR37质粒；
[0021]步骤4：PCR鉴定，扩增人GPR37基因，进行琼脂糖凝胶电泳；
[0022]步骤5：阳性克隆测序，鉴定psin
‑
flag
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GPR37载体中人GPR37基因正确性；
[0023]步骤6：包装过表达GPR37慢病毒；
[0024]步骤7：在感染过表达GPR37病毒的人食管鳞癌细胞中加入嘌呤霉素，进行筛选，构建稳定转染细胞株。
[0025]进一步的，对于GPR37基因稳定敲低，寡核苷酸编码靶向人GPR37的shRNA和对照shRNA被亚克隆进入PLKO质粒载体的EcoRI和AgeI限制性酶切位点，将sh
‑
GPR37质粒或空载体质粒包装慢病毒，通过感染病毒到人食管鳞癌细胞中，然后加入嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株。
[0026]进一步的，对于GPR37基因过表达，将人GPR37cDNA亚克隆进入psin
‑
flag质粒载体的mlμI和speI限制性酶切位点，通过测序确认序列正确，将psin
‑
flag
‑
GPR37质粒或空载体质粒包装慢病毒，感染到人食管鳞癌细胞中，通过western blot检测其过表达效应。
[0027]进一步的，S1
‑
S4为shRNA质粒的构建过程，其通过短发夹RNA干扰GPR37的表达实现。
[0028]进一步的，步骤1
‑
步骤5为稳定过表达的质粒构建过程。
[0029]进一步的，包装敲低GPR37慢病毒的具体步骤如下：
[0030]在293T细胞中瞬时转染，当293T细胞融合度到达70
‑
80％时，以PEI为转染试剂，以6cm培养皿的细胞量为例，准备两个离心管，分别加入200μL Opti
‑
MEM无血清培养基，向其中一个离心管以shGPR37质粒:REV:GAG:VSVG＝2:2:2:1的比例加入总共7μg质粒，向另外一
个离心管加入14μL(质粒：PEI＝2:1(μg/μL)),分别混匀后，将含有PEI的液体加入到含有质粒的离心管中混匀，静置17
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20分钟后，将混合液滴入细胞培养皿中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达/敲低GPR37基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：将GPR37基因稳定敲低及稳定过表达人GPR37基因质粒转染人食管鳞癌细胞，通过嘌呤霉素筛选，最终得到稳定敲低和稳定过表达GPR37基因的人食管鳞癌细胞。2.根据权利要求1所述的一种过表达/敲低GPR37基因的方法，其特征在于，稳定敲低人GPR37基因的方法包括如下步骤：S1：设计shRNAoligo，退火使两条oligo成双链；S2：将PLKO载体用EcoRI和AgeI双酶切形成线性化PLKO.1载体；S3：将上述退火后的oligo和载体连接；S4：转化涂板单克隆鉴定；S5：包装敲低GPR37慢病毒；S6：在感染敲低病毒的人食管鳞癌细胞中加入嘌呤霉素，进行筛选，构建稳定转染细胞株。3.根据权利要求1所述的一种过表达/敲低GPR37基因的方法，其特征在于，稳定过表达GPR37基因的方法包括如下步骤：步骤1：扩增人GPR37基因；步骤2：对Psin
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flag载体中的限制性酶切位点mlμI和speI进行酶切，形成线性化Psin
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flag载体；步骤3：将步骤1和步骤2产物进行连接构建Psin
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flag
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GPR37质粒；步骤4：PCR鉴定，扩增人GPR37基因，进行琼脂糖凝胶电泳；步骤5：阳性克隆测序，鉴定psin
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GPR37载体中人GPR37基因正确性；步骤6：包装过表达GPR37慢病毒；步骤7：在感染过表达GPR37病毒的人食管鳞癌细胞中加入嘌呤霉素，进行筛选，构建稳定转染细胞株。4.根据权利要求2所述的一种过表达/敲低GPR37基因的方法，其特征在于，对于GPR37基因稳定敲低，寡核苷酸编码靶向人GPR37的shRNA和对照shRNA被亚克隆进入PLKO质粒载体的EcoRI和AgeI限制性酶切位点，将sh
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GPR37质粒或空载体质粒包装慢病毒，通过感染病毒到人食管鳞癌细胞中，然后加入嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株。5.根据权利要求3所述的一种过表达/敲低GPR37基因的方法，其特征在于，对于GPR37基因过表达，将人GPR37cDNA亚克隆进入psin
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flag质粒载体的mlμI和speI限制性酶切位点，通过测序确认序列正确，将psin
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flag
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GPR37质粒或空载体质粒包装慢病毒，感染到人食管鳞癌细胞中，通过we...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟芳，张世强，胡家如，强金虎，刘素娟，刘靓，邓晓兰，朱灵，杨璐，高萌，
申请(专利权)人：无锡市锡山人民医院，
类型：发明
国别省市：