一种表达纳米抗体的重组腺相关病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达纳米抗体的重组腺相关病毒载体及其应用

【技术实现步骤摘要】
一种表达纳米抗体的重组腺相关病毒载体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种表达纳米抗体的重组腺相关病毒载体及其应用
。

技术介绍

[0002]腺相关病毒（
AAV
）是目前基因治疗项目中应用最广泛的治疗手段，其具有宿主范围广
、
安全性高
、
免疫原性低
、
表达稳定和物理性质稳定等优点
。
目前为止大多数的基因治疗药物针对的是罕见病，其市场范围受限，所以扩大
AAV
的治疗范围使其不再局限于罕见病具有广阔的前景
。
[0003]基于
AAV
的抗体治疗是一个有效的扩大其治疗范围的潜在策略
。
例如美国国立卫生研究院（
NIH
）在
2022
年公布了
AAV
病毒基因治疗
HIV
的临床结果，在该研究中，他们通过
AAV
病毒递送编码中和抗体（
bnAbs
）的
DNA
，能够在体内产生该中和抗体，从而达到治疗
HIV
的目的
。
同时
Voyager Therapeutics
通过
AAV
递送
Tau
抗体治疗阿尔兹海默症（
AD
）的研究已成功完成前期的研究工作，他们预计在
2024
年进行
IND
申报
。VectorY
公司正在研发治疗肌萎缩性侧索硬化症（
ALS
）的抗体
VTx
‑
002。
但目前为止基因治疗选用的抗体通常为免疫球蛋白
IgG
或者是单链抗体（
scFV
），这些抗体分子量大，免疫原性高
。
与传统的抗体相比，纳米抗体（
VHH
）已成为一个新的选择
。
纳米抗体分子量小，易于渗透进致密组织甚至是血脑屏障；亲和力高
、
特异性强
、
溶解性及稳定向好；免疫原性低，结构简单易于改造
。
但是纳米抗体目前面临一个重要挑战是其半衰期短，治疗往往达不到理想的效果
。
要想解决这个问题，提高纳米抗体在体内的表达水平，使其持续高效的维持体内的抗体水平是关键
。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术对通过
AAV
递送纳米抗体的各种表达元件包括启动子
、
内含子
、
信号肽和
polyA
进行了筛选优化
,
最后得到了一种最优的组合方式，和其他常用表达元件组合相比，该元件组合表达纳米抗体的效率提高
100
倍以上，并且可以长时间维持较高的血清纳米抗体的浓度，从而实现让纳米抗体通过
AAV
递送后在体内持续高效的表达
。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种表达纳米抗体的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体中含有
CAG
启动子
、BM40
信号肽和
SV40 polyA
尾，且
CAG
启动子和
BM40
信号肽位于纳米抗体编码序列的上游，
SV40 polyA
尾位于纳米抗体编码序列的下游
。
[0006]进一步地，所述重组腺相关病毒载体上含有用于
AAV
病毒包装的反向末端重复序列（
ITR
），后续将重组载体经腺相关病毒包装，可制成相关产品
。
[0007]进一步地，重组纳米抗体的
AAV
表达载体用于纳米抗体在病人或实验动物体内的内源性高表达
。
[0008]进一步地，上述
AAV
表达载体可以维持纳米抗体在实验动物体内长期的高水平，病毒注射
60
天之后体内纳米抗体浓度基本稳定，
90
天或更长时间不会下降
。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种递送系统，所述递送系统中含有上述重组腺相关
病毒载体
。
[0010]进一步地，所述递送系统为药物递送系统，药物种类包括但不限于核酸药物
、
蛋白药物等
。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供上述重组腺相关病毒载体在制备纳米抗体递送载体中的应用
。
[0012]本专利技术中，最优纳米抗体表达元件筛选方法，包括以下步骤：（1）表达载体
pssMMAAV
‑
RNY
‑
00XX
的构建在纳米抗体编码序列的
C
端添加编码纳米荧光素酶的序列，作为表达水平检测的报告基因
。
随后在该序列的上游添加不同的启动子
、
内含子
、
信号肽，下游添加不同的
polyA
终止子，总共获得
17
个含有不同表达元件的组合序列，将其连接到腺相关病毒载体上
。
[0013]（2）表达载体
pssMMAAV
‑
RNY
‑
00XX
的提取使用天根无内毒素质粒中量提取试剂盒（
DP108
），按照试剂盒使用说明书操作，提取完成的质粒取1ꢀµ
L
用核酸测定仪（
Nanodrop 0ne
）测浓度，取
500 ng
质粒跑胶电泳检测验证，提取出的质粒用于
AAV
病毒包装和生产
。
[0014]（3）
AAV
包装和纯化提前一天将
AAV293
细胞铺板，使用三质粒包装系统（
AdHelper、AAVDJ、
目的载体）转染细胞，转染
96
小时之后收取细胞上清
。
细胞上清经过切向流过滤（
Tff
）和生理盐水替换，最后将得到的样品除菌过滤和
QPCR
定量，
AAV
包装和纯化完成
。
[0015]（4）
U251、AAV293
和
C2C12
细胞侵染提前一天将
U251、AAV293
和
C2C12
细胞铺到
48
孔板中，
24
小时之后取相应数量的病毒侵染细胞，侵染病毒个数
=
侵染时细胞数（传代计数细胞数的2倍）
xMOI
（
10E5
），侵染
72
小时后取细胞上清，采用
Nan本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种表达纳米抗体的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体中含有
CAG
启动子
、BM40
信号肽和
SV40 polyA
尾，且
CAG
启动子和
BM40
信号肽位于纳米抗体编码序列的上游，
SV40 polyA
尾位于纳米抗体编码序列的下游
。2.
根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体上含有反向末端重复序列
。3.
一种递送系统，其特征在于，所述递送系统中含有权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体
。4.
权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体在制备纳米抗体递送载体中的应用
。5.
一种采用腺相关病毒重组表达纳米抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将纳米抗体编码序列连接至腺相关病毒载体上，且在所述纳米抗体编码序列的上游连接
CAG
启动子和
BM40
信号肽，在下游连接
SV40 polyA
尾
。6.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分别在

【专利技术属性】
技术研发人员：郝睿，王仲亚，张庆硕，高红英，
申请(专利权)人：瑞诺元苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：