一种治疗新生血管性眼部疾病的基因药物制造技术

本发明专利技术公开了一种治疗新生血管性眼部疾病的基因药物，本发明专利技术提供的包含重组病毒载体

【技术实现步骤摘要】
一种治疗新生血管性眼部疾病的基因药物


[0001]本专利技术属于基因治疗领域，具体地，本专利技术涉及一种治疗新生血管性眼部疾病的基因药物
。

技术介绍

[0002]新生血管性眼部疾病是一类发病率较高的引起视力损害的疾病，随着年龄的增长
、
近视的加剧或是相关代谢性疾病的发展，眼底会新生一些不必要的血管
。
这些新生血管会侵犯脉络膜
、
视网膜感光细胞层等原本正常的眼底组织，导致年龄相关性黄斑变性
(age
‑
related macular degeneration
，
AMD)、
病理性近视
(pathological myopia
，
PM)
或糖尿病视网膜病变
(diabetic retinopathy
，
DR)
等眼底疾病的发生，使视功能受损，严重的还会导致失明
。
其中，年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变是较常见的两种新生血管性眼部疾病类型
。
目前，新生血管性眼部疾病患者人数在
4000
万以上，且随着人口老龄化程度加重，患者人数还在不断上升
。
[0003]研究表明，负责眼部生理性和病理性血管生成的主要信号通路是血管内皮生长因子
(vascular endothelial growth factor
，
VEGF)
通路，多项研究表明，在人的新生血管性眼组织中
VEGF
及其受体的表达是显著上调的
。
因此，目前针对新生血管性眼部疾病，玻璃体腔注射抗
VEGF
药物是一线治疗方式
。
常用的抗
VEGF
药物有雷珠单抗
、
康柏西普和阿柏西普
。
雷珠单抗是瑞士进口的重组人源化单克隆抗
VEGF
‑
A
药物，是覆盖年龄段最广泛
、
适应症最多的抗
VEGF
药物
。
康柏西普和阿柏西普分别是我国自主研发和德国进口的融合蛋白类抗
VEGF
药物
。
玻璃体腔注射抗
VEGF
药物，会提高湿性
AMD
患者的基线视力，减轻糖尿病性黄斑水肿患者的黄斑水肿，抑制视网膜静脉阻塞患者的新生血管，抑制病理性近视
CNV
患者脉络新生血管和渗漏，以达到视力改善的效果
。
但这些药物难以长时间集中作用于眼底病灶，临床治疗时通常需要一个月注射一次，即便这样，其有效率也仅为
40
％～
60
％
。
而基因治疗方法可以提供长期且稳定的抗
VEGF
活性，成为了目前的研究热点
。
[0004]然而，目前针对新生血管性眼部疾病的基因治疗方法存在如下缺陷：适应症较少，大部分只针对黄斑变性；序列较长，
AAV
病毒的容量有限，包装效率较低；对疾病的治疗只针对于抑制新生血管的形成，对眼底细胞没有保护及修复效果，也没有抑制炎症的效果
。
有鉴于此，本专利技术旨在提供一种能够同时抑制血管新生
、
保护视网膜神经节细胞
、
减少炎症反应的基因药物
。

技术实现思路

[0005]为了克服目前本领域存在的上述技术缺陷，本专利技术的目的在于提供一种治疗新生血管性眼部疾病的基因药物
。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面提供了一种用于治疗新生血管性眼部疾病的构建体
。
[0008]进一步，所述构建体包含编码
sFLT1(1
‑
4)
或
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸；所述编码
sFLT1
(1
‑
4)
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示；所述编码
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:5
所示
。
[0009]进一步，所述构建体还包含编码
CNTF
的核苷酸；所述编码
CNTF
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:9
所示；所述编码
sFLT1(1
‑
4)
或
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸序列和编码
CNTF
的核苷酸序列通过
T2A
连接；优选地，所述构建体包括
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)、AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)、AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF、AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
‑
T2A
‑
CNTF
；更优选地，所述构建体为
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF。
[0010]在一些实施方案中，所述新生血管性眼部疾病包括湿性黄斑变性
、
糖尿病黄斑水肿
、
糖尿病视网膜病变
、
外层渗出性视网膜病变
、
视网膜静脉阻塞
、
角膜新生血管
、
病理性近视
CNV、
新生血管性青光眼
、
葡萄膜炎
、
息肉状脉络膜血管病变
、
放射性视神经病变
。
在本专利技术中，所述新生血管性眼部疾病并不局限于上述列举的具体疾病类型，发生在眼睛的任何部位
(
例如角膜
、
虹膜
、
视网膜
、
玻璃体和脉络膜
)
以致病方式生成新血管的疾病均在本专利技术的保护范围内
。
[0011]本专利技术的第二方面提供了一种用于治疗新生血管性眼部疾病的重组病毒载体
。
[0012]进一步，所述重组病毒载体包含本专利技术第一方面所述的构建体和病毒载体骨架
。
[0013]进一步，所述病毒载体包括腺相关病毒载体
、
腺病毒载体
、
慢病毒载体
、
逆转录病毒载体
、
单纯疱疹病毒载体
、
杆状病毒载体
、
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于治疗新生血管性眼部疾病的构建体，其特征在于，所述构建体包含编码
sFLT1(1
‑
4)
或
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸；所述编码
sFLT1(1
‑
4)
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示；所述编码
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:5
所示
。2.
根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述构建体还包含编码
CNTF
的核苷酸；所述编码
CNTF
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:9
所示；所述编码
sFLT1(1
‑
4)
或
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸序列和编码
CNTF
的核苷酸序列通过
T2A
连接；优选地，所述构建体包括
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)、AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)、AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF、AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
‑
T2A
‑
CNTF
；更优选地，所述构建体为
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF。3.
一种用于治疗新生血管性眼部疾病的重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体包含权利要求1或2所述的构建体和病毒载体骨架
。4.
根据权利要求3所述的重组病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包括腺相关病毒载体
、
腺病毒载体
、
慢病毒载体
、
逆转录病毒载体
、
单纯疱疹病毒载体
、
杆状病毒载体
、
仙台病毒载体
、
痘病毒载体
、
双生病毒载体；优选地，所述病毒载体为腺相关病毒载体；更优选地，所述腺相关病毒载体选自
AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12
或其任意组合；最优选地，所述腺相关病毒载体为
AAV2。5.
一种权利要求3或4所述的重组病毒载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)、AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)、AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF
或
AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
‑
T2A
‑
CNTF
质粒载体的构建；
(2)
将步骤
(1)
中构建得到的质粒载体和
AAV2、pHelper
共转染到细胞中后培养所述细胞；
(3)
收集细胞上清获得感染性病毒颗粒，即为权利要求3或4所述的重组病毒载体
。6.
根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
所述的
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)、AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)、AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF
或
AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
‑
T2A
‑
CNTF
质粒载体中编码
sFLT1(1
‑
4)
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示，编码
sFLT1(2
‑
3)
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:5
所示，编码
CNTF
的核苷酸序列如
SEQ ID NO:9
所示；优选地，步骤
(1)
所述的
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
或
AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
质粒载体的构建包括如下步骤：以
pAAV
‑
SFFV
质粒为基因表达的骨架载体，合成
sFLT1(1
‑
4)
或
sFLT1(2
‑
3)
编码
cDNA
序列，通过同源重组将其插入到
pAAV
‑
SFFV
质粒中，转化进入大肠杆菌
DH5
α
中，挑取单克隆，得到
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
或
AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
质粒载体；优选地，步骤
(1)
所述的
AAV
‑
sFLT1(1
‑
4)
‑
T2A
‑
CNTF
或
AAV
‑
sFLT1(2
‑
3)
‑
T2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂忱，吴理达，靳瑾，李航，张巍，顾雨春，
申请(专利权)人：呈诺再生医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：