一种哺乳动物红光控制转录激活装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种哺乳动物红光调控的转录激活装置

【技术实现步骤摘要】
一种哺乳动物红光控制转录激活装置/系统及其构建方法和在基因治疗中的应用


[0001]本专利技术涉及合成生物学
、
光遗传学
、
基因治疗等多学科交叉领域，具体涉及一种哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统
(REDMAP 2.X)
及其构建方法，高效
、
精准
、
快速诱导哺乳动物基因的转录表达，以及可以由腺相关病毒
AAV 递送
REDMAP2.X
装置
/
系统，实现对疾病精准
、
高效
、
长期的基因治疗
。

技术介绍

[0002]合成生物学，以其自下而上的特点，通过对基因线路的改装实现对生命的重新定义
。
对于细胞生命活动的精准调控需要通过构建人工调控的基因开关实现
。
精确的控制系统在基础生物学和转化生物医学研究的各个领域具有重要作用，如治疗药物的可控释放
、
表观遗传的特异性表达等
。
[0003]对于基因表达的调控，主要是通过一些小分子化学物质实现的，如
PCA、 RES、ABA
等，但是这些小分子调控系统具有一定毒性
、
可调性差等局限性
。
光因为其无毒
、
在自然界中普遍存，时空特异性强等特点，成为理想的基因表达的理想诱导剂
。
光遗传技术在调控基因表达方面也具有广泛的应用，可以高度的时空特异性控制工程化细胞的生命活动，为无痕
、
远程控制的精确调控医学提供了潜在的应用价值，在基因工程领域和精准治疗医学中具有重要意义
。
目前，来自植物
、
真菌和细菌的天然光敏蛋白已被开发成为广泛的光遗传学转录装置
/
系统，在基因工程
、
转化再生医学
、
表观遗传学领域等得到了广泛应用
。
然而目前这些光调控的基因转录装置
/
系统仍然具有一定的局限性
。
一些由蓝光或紫外光作为诱导剂的光遗传学工具
(
如
CRY2/CIBN
，
LOV
，
Magnet
等
)
，具有一定的光毒性
、
对组织的穿透能力不强，对于深部的疾病治疗效果差，限制了在医学临床中的应用
。
由远红光或红光作为诱导剂的基因转录开关，虽然无光毒性
、
对组织的穿透能力也更强，但模块元件往往较大，如
BphP1/PpsR2
；这些装置
/
系统转录激活的效率较低，对光的感应不灵敏，需要长期光照，这些不足限制了其在疾病临床治疗的应用
。
近期，一种由红光调控的新型转录装置
/ 系统
(REDMAP)
被开发出来，其具有诱导效率高
、
对红光响应迅速等特点
。
但由于该系统在应用过程中需要额外加入或表达
PCB
色素，也限制了在对疾病实行基因治疗的转化和应用
。
[0004]基因治疗作为一种新兴
、
治疗效果显著的疾病治疗模式，通过将目的基因放进特定的载体中，然后导入体内，携带目的基因的载体在内体的细胞中能制造需要的药物蛋白，从而实现对疾病的治疗
。
腺相关病毒
AAV
因其不会将外缘基因整合到宿主基因组中
、
免疫原性低
、
宿主范围广
、
在体内表达外源基因时间长等诸多优点，成为了基因治疗中最安全有效的基因传递载体
。
但由于
AAV 的包装范围有限
(<4.7kb)
，在临床应用中受到了限制
。
亟待开发一种模块小
、
操作简单
、
诱导效率高
、
快速灵敏的基因转录表达装置
/
系统，以推动
AAV
基因治疗中在临床中的广泛应用
。
[0005]为了克服
AAV
载体递送局限性，结合红光组织穿透力强
、
精准的时空特异性以及无毒性，专利技术一种在哺乳动物中由红光调控的
、
操作简单
、
安全高效
、
诱导效率高
、
快速响应
、
模块元件小
、
不需要额外加入色素的转录激活装置
/
系统
(REDMAP 2.X)
，对基础生物研究
、
再生医学的应用
、
和精准的基因治疗具有潜在的临床应用价值
。

技术实现思路

[0006]针对上述所述的局限性，本专利技术提出一种哺乳动物红光调控的转录激活装置
/
系统
(
简称
REDMAP 2.X
装置
/
系统
)
，实现了由红光调控哺乳动物细胞的基因转录激活
。
本专利技术所述装置
/
系统具有诱导效率高
、
快速响应
、
时空特异性强
、
组织穿透力强
、
无毒副作用
、
模块元件小以及可调性好等特点
。
相比较于 REDMAP
系统，本专利技术所述装置
/
系统在哺乳动物中不需要额外添加或表达色素分子，更具有安全无毒
、
操纵简单的特点，在一定程度上也缩减了装置
/
系统模块的复杂度
。
[0007]本专利技术通过
660nm
红光照射短短的几秒，即可高效
、
快速地激活报告基因的转录表达，且基因的表达量可通过调节电源的光强以及改变光照的时间得以控制；同时，可以通过控制光照区域，可实现对基因表达的空间控制，具有很强时空特异性
。
同时本专利技术中，所述哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统具有很低的本底泄露
、
很高的激活效果，可实现高效的诱导激活效率，具有很强的实用性
。
此外，本专利技术所述哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统在
780nm
的远红光照射下可以关闭转录激活，实现对基因转录开启和关闭的双重控制，具有很强的可调控性
。
[0008]综上，本专利技术可实现对哺乳动物细胞基因环路的快速
、
高效
、
精准的转录激活控制，在哺乳动物基础生物研究
、
基因工程
、
表观遗传学和转化医学领本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，包含红光感受元件
、
转录激活元件和效应元件
。2.
如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述红光感受元件包括：细菌来源的红光光敏蛋白
DrBphp、PnBphp、FnBphp、
含有
DNA
结合结构域的
Gal4
蛋白以及两个蛋白之间的融合肽
。3.
如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述转录激活元件包括：与红光光敏蛋白相互作用的纳米伴侣蛋白
LDB3、LDB14、
转录激活因子以及
LDB3/LDB14
与转录激活因子之间的连接肽
。4.
如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述效应元件包括：诱导型启动子及目的基因
。5.
如权利要求4所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述诱导型启动子包括：操纵子和诱导型弱启动子；所述目的基因可为任何有意义蛋白的基因序列
。6.
如权利要求2所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述细菌来源的红光光敏蛋白
DrBphp
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述细菌来源的红光光敏蛋白
PnBphp
为
DrBphp
蛋白
N
端融合拟南芥红光蛋白
PhyA
的
NTE
结构域，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；所述细菌来源的红光光敏蛋白
FnBphp
为
DrBphp
蛋白
N
端融合真菌红光蛋白
FphA
的
NTE
结构域，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。7.
如权利要求2所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述
Gal4
为可以与特定
DNA
序列结合的蛋白质，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示；其中，所述
Gal4
与细菌来源的红光光敏蛋白之间的连接肽的氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。8.
如权利要求3所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述纳米伴侣蛋白
LDB3
和
LDB14
可以与所述细菌来源的红光光敏蛋白
DrBphp、PnBphp、FnBphp
相互作用，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.6
‑7所示
。9.
如权利要求3所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述转录激活因子具有招募
RNA
聚合酶的功能，包括
VP64、VP16、p65、VPR、p65
‑
HSF1
，氨基酸序列如
SEQ ID NO.8
‑
12
所示
。10.
如权利要求3所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述
LDB3
纳米伴侣蛋白
N
端融合表达了不同拷贝数的入核信号
NLS
，所述
NLS
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.13
所示；其中，所述纳米伴侣蛋白和转录激活因子之间的连接肽，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.14
所示
。11.
如权利要求5所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述的诱导型启动子为
P5×
UAS
‑
(hCMVmin)
和
P5×
UAS
‑
(TATA)
，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.15
‑
16
所示；其中，所述诱导型启动子在没有转录激活子招募
RNA
聚合酶的情况下不能启动下游基因的转录表达
。12.
如权利要求4所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述效应元件可为任何有意义蛋白的基因序列，包括
SEAP、EGFP
和
Luciferase
报告基因，其氨基酸序列分别如
SEQ ID NO.17
‑
19
所示；基因治疗的药物蛋白
Insulin
和
mTSLP
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.20
‑
21
所示
。13.
如权利要求1所述的哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统，其特征在于，所述装
置
/
系统可由波长为
660
±
10nm
的红光诱导激活目的基因的表达，在
780nm
远红光的照射下可关闭基因转录
。14.
一种哺乳动物红光调控转录激活装置
/
系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
构建红光感受元件：所述的红光感受元件包括含不同结构域的红光光敏蛋白
DrBphp、PnBphp、FnBphp
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
‑3所示，以及含有
DNA
结合结构域的
Gal4
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
，两者之间通过连接肽形成融合蛋白，连接肽的氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示；
(2)
构建转录激活元件：所述转录激活元件包括与红光光敏蛋白相互作用的纳米伴侣蛋白
LDB3
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.6
所示，其中
LDB3
的
N
端融合表达了两拷贝数入核信号2×
NLS
，
NLS
的氨基酸序列如
SEQ ID NO.13
所示
。
以及具有招募
RNA
聚合酶的转录激活因子
p65
‑
HSF1
，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.12

【专利技术属性】
技术研发人员：叶海峰，乔龙亮，牛灵雪，王智浩，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：