本发明专利技术公开了一种适用于宫颈组织ｍｉｃｒｏＲＮＡ实时荧光定量ＰＣＲ研究的新内参分子的筛选方法；本发明专利技术采用的技术步骤为：利用ＭｉｃｒｏＲＮＡ芯片对人类ＭｉｃｒｏＲＮＡ探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常组织表达恒定且表达丰度高的ＭｉｃｒｏＲＮＡ，作为候选的内参；分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光定量ＰＣＲ进行验证；运用ｇｅＮｏｒｍ?ｓｏｆｔｗａｒｅ及ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于宫颈组织ＭｉｃｒｏＲＮＡ研究的内参分子，运用本发明专利技术方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组织标本在ＲＮＡ的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量ＰＣＲ检测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性第二大的恶性肿瘤，大量的流行病学资料表 明，高危人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌及其癌前病变发病的必要条件，但是单一 HPV 感染并不足以引起宫颈上皮的恶性转化。微小RNAOnicro RNA，简称miRNA)是生物体内源 长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对 基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。到目前为止，已报道有几千种miRNA 存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。许多研究证明，miRNA可以用以标记癌症，例如，美国俄亥俄州立大学的研究通过 分析来自肺部、宫颈、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品540份，发现了由过量表 达的大部分miRNA组成的实体癌症miRNA信号。而对于编码蛋白的肿瘤抑制子和致癌基因， 这些miRNA差异表达作用的靶目标会大量富集，这说明miRNA在实体肿瘤的癌症发病机理 中发挥着重要的作用。提示其极有可能在HPV致宫颈癌的发生发展过程中发挥关键作用。 近年来的研究已发现若干MicroRNA在宫颈癌中表达异常，因此利用实验生物学及生物信 息学方法对与宫颈癌相关的MicroRNA进行研究是当前研究的热点之一。要了解MicroRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地 定量检测MicroRNA基因的表达。成熟的MicroRNA —般只有二十几个碱基，同族的MicroRNA 之间通常只有一两个碱基的差别，而且绝大部分MicroRNA在细胞中的表达水平都比较低， 这些特性给传统的印迹杂交(northern blot)，生物芯片技术(microarray)和RT-PCR等 常规手段带来了极大的困难和挑战。随着PolyA RT-PCR技术、尤其是stem-loopRT-PCR技 术的发展，实时荧光定量PCR (real-time PCR)已经成为目前MicroRNA定量检测的主要方 法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶MicroRNA，定量线性范围宽；而 且可精确区分同一家族中序列高度同源的MicroRNA，能精确检测只有一个碱基差别的不同 micro RNA的表达水平。但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合 的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录效 率上可能存在的差别。以往对mRNA的研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型 的细胞或实验因素作用下有范围的恒定。在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变 化的，盲目地使用内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能 引致错误甚至相反的结论。MicroRNA在细胞中的表达水平低仅占总RNA的0. 01%，且其 表达具有更大的组织特异性，所以选择合适的内参对目的MicroRNA的表达进行标准化 就显得尤为重要。目前文献中用来作为MicroRNA QRT-PCR内参的分子主要有let_7a，MicroRNA-103a, MicroRNA-16, MicroRNA-191、MicroRNA-26b 等和小分子 RNA (RNU48、5S)， 因所研究组织的不同其选择内参也不同。到目前为止，对宫颈病变相关的特异性micro RNA的定量研究中多盲目的参照在 其他肿瘤中使用过的内参分子(RNU48、5S、let-7a)，但对其在宫颈组织中表达的恒定性及 其作为内参的适用性均未进行探究。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的，在于针对现有宫颈组织中特异性MicroRNA的定量研究中内 参使用的研究效果上的缺陷，提出了一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研 究的新内参分子的筛选方法；运用本专利技术方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组 织标本在RNA的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检 测的数据进行校正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的筛选方 法，其步骤为(1)利用MicroRNA芯片对人类MicroRNA探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常 组织表达恒定且表达丰度高的MicroRNA，作为候选的内参；(2)分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光 定量PCR进行验证；(3)运用geNorm software及NormFinder两个专用的内参分析软件进行数据分 析，从而发现可适用于宫颈组织MicroRNA研究的内参分子。进一步的，所述步骤(2)中，所用标本均为临床阴道镜下活检的组织。进一步的，通过步骤(2)采集的若干份标本中，每份标本分两份，一份经液氮速冻 后置液氮保存，另一份经甲醛固定后以石醋包埋。更进一步的，所述步骤(2)中，经液氮冻存组织用于MicroRNA芯片检查筛选内参 分子及对候选的内参分子进行实时荧光定量PCR的验证。更进一步的，所述步骤(2)中，经石醋包埋后的组织用于进行组织学确认以验证 是否发生病理学改变。本专利技术的有益效果在于本专利技术针对现有宫颈组织中特异性MicroRNA的定量研究中内参使用的研究效果上的缺陷，提出了一种适用于宫颈组织micro RNA实时荧光定量PCR研究的新内参分子的 筛选方法；运用本专利技术方法筛选并证实的内参分子，可避免不同宫颈组织标本在RNA的产 量、质量及逆转录效率上可能存在的差别，更好的对实时荧光定量PCR检测的数据进行校 正和标准化，提高研究的准确性及可靠性。附图说明图1是本专利技术的筛选步骤中总RNA电泳的数据图；图2是本专利技术的筛选步骤中，MiRNA的质检图；图3是正常宫颈组织与宫颈癌组织中的差异MicroRNA表达谱图4是miRNA RT-PCR产物大小定位电泳结果图；图5是MicroRNA RT-PCR产物序列确定-内参U6和has-mir_23a测序结果图；图6是MicroRNA real-time PCR引物扩增标准曲线和溶解曲线图；图7是各候选内参分子在宫颈正常及宫颈癌组织中的表达差异数据图；图8是对候选内参基因进行geNorm software分析结果图。具体实施例方式下面结合附图对本专利技术进行进一步的解释和说明如图1-8所示本专利技术选用宫颈正常上皮组织及宫颈癌组织各30例，正常宫颈上皮来源采集于来浙江大学医学院附属妇产科医院进行宫颈疾病筛查的自愿者，宫颈癌组织来源于初次诊 断的未经治疗的宫颈癌患者(鳞癌23例、腺鳞癌4例、腺癌3例)。所有标本均为阴道镜下 活检的组织，每份标本分两份，一份经液氮速冻后置液氮保存，另一份4%甲醛固定后石醋 包埋。液氮冻存组织用于Micro RNA芯片检查筛选内参分子及对候选的内参分子进行实时 荧光定量PCR的验证。石醋切片用于进行组织学确认正常组织中没有病理改变，肿瘤组织 中癌成份大于80%。临床分期参照2009年国际妇产科联盟(FIGO)，细胞分化程度按细胞 形态分高、中和低分化。30例宫颈癌中I期22例、II期6例、II期以上2例，高分化5例、 中分化21例、低分化4例。从液氮冻存组织中分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于宫颈组织ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ实时荧光定量ＰＣＲ研究的新内参分子的筛选方法，其特征在于，该筛选方法的步骤为： （１）利用ＭｉｃｒｏＲＮＡ芯片对人类ＭｉｃｒｏＲＮＡ探针进行筛选，选出在宫颈癌及宫颈正常组织表达恒定且表达丰度高的ＭｉｃｒｏＲＮＡ，作为候选的内参； （２）分别选取正常宫颈上皮组织和癌变宫颈组织作为临床宫颈组织标本，用荧光定量ＰＣＲ进行验证 （３）运用ｇｅＮｏｒｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ及ＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒ两个专用的内参分析软件进行数据分析，从而发现可适用于宫颈组织ＭｉｃｒｏＲＮＡ研究的内参分子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢幸，沈源明，吕卫国，叶枫，李阳，王芬芬，万小云，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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