一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法，先在培养毕赤酵母工程菌种子液的过程中进行低频超声处理，再将种子液接种至发酵罐中培养至溶氧快速上升，然后流加甘油水溶液进行碳源补料，补料结束后加入甲醇进行诱导培养，并在诱导培养后期加入植物乳杆菌发酵液作为补充料，继续培养直至发酵结束

【技术实现步骤摘要】
一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法
。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多
、
分布最广的功能性蛋白，主要存在于存在于皮肤
、
肌腱
、
软骨及骨组织中，占蛋白质总量的
25
％～
30
％
。
胶原蛋白由结合在一起的氨基酸组成，形成三重螺旋状的原纤维，具有促进组织再生
、
伤口愈合
、
治疗皱纹和皮肤老化等作用
。
由于动物来源的胶原蛋白在应用中存在安全隐患，因此重组人源胶原蛋白的生产成为当前的主流发展趋势
。
皮肤中
III
型胶原蛋白的流失是皮肤产生皱纹
、
衰老的主要原因，因此，重组
III
型人源化胶原蛋白成为医学美容除皱领域的一个研究热点
。
目前，重组
III
型人源化胶原蛋白的生产方法主要是以毕赤酵母工程菌经过发酵得到，主要存在生产周期长
、
产率低的问题，是重组
III
型人源化胶原蛋白市场扩展的主要制约因素
。
因此，为了缩短生产周期，提高产率，对发酵工艺的优化是一个关键的研发方向
。

技术实现思路

[0003]基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法/>。
[0004]本专利技术提出的一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法，包括以下步骤：
[0005]S1、
将表达重组
III
型胶原蛋白的毕赤酵母
(Pichia pastoris)
工程菌活化后的菌液接种至含种子培养基的第一种子罐中培养一段时间，然后进行低频超声处理，得到一级种子液；将所述一级种子液接种至含种子培养基的第二种子罐中培养一段时间，然后进行低频超声处理，得到二级种子液；
[0006]S2、
将所述二级种子液接种至含发酵培养基的发酵罐中培养至溶氧快速上升，然后流加甘油水溶液，培养至菌体湿重为
180
‑
200g/L
，停止流加甘油水溶液，开始流加甲醇进行诱导培养，诱导培养
45
‑
50h
时，一次性加入补充料，继续培养直至发酵结束
。
[0007]优选地，
S1
中，将表达重组
III
型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌活化后的菌液按接种量为
0.5
‑1％接种至含种子培养基的第一种子罐中于
26
‑
30℃、180
‑
220r/min、
氨水调节
pH
为
4.8
‑
5.2、
溶氧
≥25
％的条件下培养
12
‑
14h
，然后在超声波频率为
10
‑
30KHz
，超声波强度为
60
‑
80W/L
，温度为
26
‑
30℃、
转速为
180
‑
220r/min
的条件下低频超声处理
10
‑
20min
，得到一级种子液
。
[0008]优选地，
S1
中，将所述一级种子液按接种量为5‑8％接种至含种子培养基的第二种子罐中于
26
‑
30℃、180
‑
220r/min、
氨水调节
pH
为
4.8
‑
5.2、
溶氧
≥25
％的条件下培养
12
‑
14h
，然后在超声波频率为
10
‑
30KHz
，超声波强度为
100
‑
120W/L
，温度为
26
‑
30℃、
转速为
180
‑
220r/min
的条件下低频超声处理
30
‑
40min
，得到二级种子液
。
[0009]优选地，
S1
中，所述种子培养基包括下述组分：酵母提取物8‑
10g/L、
蛋白胨
15
‑
20g/L、
葡萄糖
15
‑
20g/L、CaSO4·
2H2O 0.3
‑
0.5g/L、MgSO4·
7H2O 4
‑
8g/L、K2SO
4 5
‑
10g/L。
[0010]优选地，
S2
中，将所述二级种子液按接种量为8‑
10
％接种至含发酵培养基的发酵罐中，于
26
‑
30℃、180
‑
220r/min、
氨水调节
pH
为
4.8
‑
5.2、
溶氧
≥25
％的条件下培养至溶氧快速上升
。
[0011]优选地，所述发酵培养基包括下述组分：
85
％ H3PO
4 20
‑
25mL/L、CaSO4·
2H2O0.3
‑
0.5g/L、MgSO4·
7H2O 4
‑
8g/L、K2SO
4 5
‑
10g/L、CuSO4·
5H2O 3
‑
5mg/L、MnSO4·
H2O1
‑
1.5mg/L、ZnSO4·
7H2O 6
‑
8mg/L、FeSO4·
7H2O 10
‑
12mg/L。
[0012]优选地，所述甘油水溶液的浓度为
40
‑
60wt
％，所述甘油水溶液的流加速度为
10
‑
15mL/h/L
，所述甲醇的流加速度为3‑
6mL/h/L。
[0013]优选地，所述补充料为植物乳杆菌发酵液，所述植物乳杆菌发酵液的制备方法为：将植物乳杆菌按接种量为2‑5％接种至含下述组分的培养基的发酵罐中进行培养：葡萄糖
15
‑
20g/L、
蛋白胨5‑
8g/L、
酵母提取物3‑
5g/L、K2SO
4 1
‑
2g/L、MgSO4·
7H2O 4
‑
8g/L、MnSO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
将表达重组
III
型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌活化后的菌液接种至含种子培养基的第一种子罐中培养一段时间，然后进行低频超声处理，得到一级种子液；将所述一级种子液接种至含种子培养基的第二种子罐中培养一段时间，然后进行低频超声处理，得到二级种子液；
S2、
将所述二级种子液接种至含发酵培养基的发酵罐中培养至溶氧快速上升，然后流加甘油水溶液，培养至菌体湿重为
180
‑
200g/L
，停止流加甘油水溶液，开始流加甲醇进行诱导培养，诱导培养
45
‑
50h
时，一次性加入补充料，继续培养直至发酵结束
。2.
根据权利要求1所述的重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法，其特征在于，
S1
中，将表达重组
III
型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌活化后的菌液按接种量为
0.5
‑1％接种至含种子培养基的第一种子罐中于
26
‑
30℃、180
‑
220r/min、
氨水调节
pH
为
4.8
‑
5.2、
溶氧
≥25
％的条件下培养
12
‑
14h
，然后在超声波频率为
10
‑
30KHz
，超声波强度为
60
‑
80W/L
，温度为
26
‑
30℃、
转速为
180
‑
220r/min
的条件下低频超声处理
10
‑
20min
，得到一级种子液
。3.
根据权利要求1所述的重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法，其特征在于，
S1
中，将所述一级种子液按接种量为5‑8％接种至含种子培养基的第二种子罐中于
26
‑
30℃、180
‑
220r/min、
氨水调节
pH
为
4.8
‑
5.2、
溶氧
≥25
％的条件下培养
12
‑
14h
，然后在超声波频率为
10
‑
30KHz
，超声波强度为
100
‑
120W/L
，温度为
26
‑
30℃、
转速为
180
‑
220r/min
的条件下低频超声处理
30
‑
40min
，得到二级种子液
。4.
根据权利要求1所述的重组Ⅲ型胶原蛋白的生产方法，其特征在于，
S1
中，所述种子培养基包括下述组分：酵母提取物8‑
10g/L、
蛋白胨
15
‑
20...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正亮，
申请(专利权)人：安徽科门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：