一种检测胃癌相关制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种用于胃癌诊断

【技术实现步骤摘要】
一种检测胃癌相关miRNA基因的FISH探针、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种检测胃癌相关
miRNA
基因的
FISH
探针 ，同时涉及其制备的试剂盒及其应用
。

技术介绍

[0002]肿瘤的发生发展与基因密不可分，环境因素以及遗传等的因素都可以导致或者引起
DNA
的变化，从而激活原癌基因或引起肿瘤抑制基因的灭活，引起基因表达水平的异常，使靶细胞发生转化
。
研究发现，超过 50% 的
miRNA
基因位于原癌基因或抑癌基因的染色体脆性位点（
fragile sites
）或相关遗传区域
。miRNA
基因往往在肿瘤中发生异常表达，其在肿瘤的发生发展过程中能够作为致癌因子或抑癌因子参与肿瘤的各个过程，对比肿瘤细胞与正常组织细胞间来源的
miRNA
发现，其表达谱具有明显差异
。
研究表明
miRNA 在细胞凋亡
、
增殖
、
分化
、
血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，参与人体大约
30
％的基因调节，与心血管疾病
、
肿瘤
、
免疫紊乱及代谢紊乱等多种发病有关
。
已有研究发现若干 miRNA 的负调控作用与白血病
、
乳腺癌
、
肺癌
、
肝癌和结肠癌等高度相关
。
[0003]胃癌是人类消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其起源于胃粘膜上皮，确切发病机制尚不清楚
。
据统计报告，在全球范围内，胃癌的发病率（
5.6%
）和死亡率（
7.7%
）分别排在第五和第四位
。
我国是胃癌的高发地区，发病率和死亡率均排在第三位，且呈现逐年上升趋势
。
胃癌的治疗策略是外科手术治疗为主的综合性治疗，手术被认为是目前唯一的根治性治疗方法
。
随着手术技术的进步和放疗
、
化疗
、
新辅助治疗的实施，胃癌患者的5年生存率有所提高
。
但是，由于早期胃癌缺乏特异性症状，早期诊断率低，大多数患者在确诊时己是晚期
。
许多患者在确诊后无法手术
、
或在根治性胃切除术后复发，预后不良
。
有报道指出，胃癌的死亡原因与血运转移
、
淋巴浸润和腹膜播散有关
。
[0004]因此，进一步研究胃癌发生发展的机制，明确调控靶点，特别是筛选预后相关免疫标志物，在早期阶段实行有效检测和预测，选择合适的治疗方案和指导临床诊治，是降低死亡率
、
改善预后不良的关键
。miRNA 与胃癌的发生发展关系非常密切，通过研究在胃癌癌变组织中表达异常的
miRNA
，可进一步阐明胃癌的发病机制，并将有助于胃癌的早期检测诊断
、
治疗以及预后的判断
。
[0005]肿瘤的发生发展过程，始终与机体的免疫系统密切相关
。
肿瘤浸润性淋巴细胞（
Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs
）由
T
细胞
、B
细胞和
NK
细胞组成，其中，
T
细胞亚群包括细胞毒性
T
细胞（
CD8
+
）
、
辅助性
T
细胞（
CD4
+
）
、
记忆
T
细胞等多种亚型
。
白细胞分化抗原（
Cluster of Differentiation, CD
）
CD4
+
T
细胞可进一步分化为不同亚群，通过不同转录因子，分泌细胞因子和趋化因子，招募不同的免疫细胞和协调不同的免疫效应机制
。CD8
+
T
细胞在人类肿瘤免疫微环境中高度增殖
、
克隆和动态分化，其被活化后成为细胞毒性
T
细胞
(CytotoxicT Lymphocyte, CTL)
，在识别肿瘤抗原后，可诱导肿瘤细胞死亡，直接杀伤肿瘤细胞，因此，在抗肿瘤细胞免疫中和决定患者临床预后方面起着相当重要的作用
。
正常情况下，机体内
CD4
+
T
细胞和
CD8
+
T
细胞保持一定比例，以维持机体免疫内环境的平衡状态
。
有研
究发现，
CD62L
low
CD4
+
T
细胞与效应
CD8
+
T
细胞显著相关，并与效应
CD8
+
T
细胞表面的
PD
‑1表达显著相关
。
[0006]MicroRNAs
（
miRNAs
）是近些年来发现的一类内源性的具有调控功能的非编码小分子
RNA
，其大小长约
20
‑
25
个核苷酸
。miRNA
基因在细胞核内由
RNA
聚合酶
II
转录后形成初级转录产物（
pri
‑
RNAs
），
pri
‑
RNA
经过一系列加工处理后成为
19
‑
25bp
左右的成熟
miRNA。
成熟的
miRNA
在细胞中可以与蛋白质结合形成
RNA
诱导沉默复合物（
RNA induced silencing complex , RISC
）
。RISC
与靶
mRNA
基因不完全配对时，可以阻断
miRNA
的翻译过程，降低表达；
RISC
与靶
mRNA
完全配对时，则可以导致
mRNA
的降解
。miRNA
通过阻断或者降解的
mRNA
表达来控制靶基因的表达，从而达到调控基因的分化
、
凋亡等一系列的过程
。
[0007]在
miRNA
检测分析方面，目前国内外多采用基因芯片筛选，
RT
‑
PCR
定量分析等方法
。
基因芯片可以直接测定一份标本的多种
miRNA
，但是此方法背景和杂信号干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测胃癌相关
miRNA
基因的
FISH
探针，其特征在于，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2. 一种包含权利要求1所述的一种检测胃癌相关
miRNA
基因的
FISH
探针的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含浓度为
40
‑
60
μ
mol/L 的
FISH
探针溶液
。3.
根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含
anti
‑
CD4
抗体
、anti
‑
CD8
抗体和
4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚复染液
。4.
根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，
anti
‑
CD4
抗体的浓度为
0.9
‑
1.1mg/mL、anti
‑
CD8
抗体的浓度为
0.9
‑
1.1mg/mL、4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚复染液的浓度为
0.9
‑
1.1
μ
g/mL。5.
一种权利要求2‑4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：1）对待测样品进行预处理；2）将
FISH
探针滴加于待测样品上，使
FISH
探针和待测样品进行变性杂交；3）对步骤2）杂交后的样品进行洗涤；4）依次将封闭液
、
抗体滴加于步骤3）处理后的样品上，使抗体和样品进行特异性结合；5）使用
4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚复染液进行复染；6）使用荧光显微镜观察结果
。6.
根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，步骤1）具体为：（1‑1）将载玻片烘片；（1‑2）将载玻片用二甲苯处理脱蜡；（1‑3）将载玻片依次经
70%、80%、90%、100%
乙醇进行梯度脱水，静置晾干；（1‑4）滴加预杂交液于样本上，盖膜后，
37℃
孵育封闭
30min。...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁敏，肖瑶，蒋昭筠，屈高文，余桂芳，周新科，彭彬，林映琳，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第五医院广州再生医学与健康广东省实验室附属医院，
类型：发明
国别省市：