一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法技术

本申请涉及细胞分化技术领域和心肌组织再生医学技术领域，具体公开了一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法

【技术实现步骤摘要】
一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法


[0001]本申请涉及细胞分化
和心肌组织再生医学
，尤其是涉及一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法，本申请还涉及一种含有
KDM5
抑制剂的诱导分化培养基，及利用该诱导分化培养基诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞的方法
。

技术介绍

[0002]胚胎干细胞
(Embryonic stem cell
，
ESCs
，简称
ES
细胞
)
具有可以分化为任何体细胞的潜能，导致人们对胚胎干细胞在再生医学
、
药物发现
、
体外疾病建模和发育生物学领域的应用寄予厚望
。
[0003]心脏肌肉是身体中再生能力最差的组织之一
。
现有研究表明，成年哺乳动物的心脏不包含心脏干细胞，而且哺乳动物的心肌细胞
(Cardiomyocyte,CMs)
在出生后不久便丧失自我更新的潜力，再生能力受到限制
。
因此，由
ES
细胞衍生的心肌细胞为心脏疾病的心肌细胞损伤修复和药物筛选提供了材料
。
然而，目前常用的小分子抑制剂诱导心肌细胞的方法效率不稳定，不利于大规模的心肌细胞生产
。
[0004]因此，提供一种方法简单，操作简单，并且能够大幅度提高人胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞的诱导方法以解决现有技术的不足，甚为必要
。
专利
技术实现思路

[0005]本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法
。
本申请的方法显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率
。
[0006]为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
[0007]第一方面，本申请提供了一种
KDM5
抑制剂在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞中的应用
。
[0008]在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞过程中，本申请专利技术人经过大量研究及试验发现，添加
KDM5
抑制剂作为额外添加的诱导因子均能够明显提高
TNNT2
阳性细胞的比例，说明
KDM5
抑制剂可以提高胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率
。
[0009]作为本申请所述应用的优选实施方式，所述
KDM5
抑制剂包括
CPI455。
[0010]利用
CPI455
介导的
KDM5
抑制，可以提高胚胎干细胞
(ES
细胞
)
在定向分化为心肌细胞诱导过程中的
H3K4me3
整体水平，进而显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率
。
[0011]作为本申请所述应用的优选实施方式，所述
KDM5
抑制剂配制成诱导分化培养基，在诱导分化培养基中
KDM5
抑制剂的质量浓度为5‑
10
μ
M
，优选地，所述
KDM5
抑制剂的质量浓度为5μ
M。
[0012]在胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的过程中，采用5μ
M CPI455
和
10
μ
M CPI455
作为额外添加的诱导因子均能够明显提高
TNNT2
阳性细胞的比例，但是5μ
MCPI455
的效果更佳
。
[0013]作为本申请所述应用的优选实施方式，所述
KDM5
抑制剂的使用时间为诱导定向分化时间的第0天至第
15
天，优选地，所述
KDM5
抑制剂的使用时间为诱导定向分化时间的第0天至第7天
。
[0014]第二方面，本申请提供了一种诱导分化培养基，所述诱导分化培养基包括第一分化培养基
、
第二分化培养基和第三分化培养基；
[0015]所述第一分化培养基包括基础培养基
、5
‑
10
μ
M CPI455
和6μ
M WNT
信号通路激活剂
CHIR99021
；
[0016]所述第二分化培养基包括基础培养基
、5
‑
10
μ
M CPI455
和
2.5
μ
M WNT
信号通路抑制剂
IWP2
；
[0017]所述第三分化培养基包括基础培养基
、200
μ
g/mL
抗坏血酸和
10
μ
g/mL
胰岛素
。
[0018]本申请通过设计的诱导分化培养基可以高效获得能够自主跳动的心肌细胞
。
[0019]优选地，所述第三分化培养基还含有5‑
10
μ
M CPI455。
添加
CPI455
可以促进
TNNT2
阳性细胞的产量，说明
CPI455
显著提高了胚胎干细胞分化为心肌细胞的效率
。
[0020]第三方面，本申请提供了上述诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞中的应用
。
[0021]第四方面，本申请提供了一种体外诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法，所述方法利用上述诱导分化培养基培养获得心肌细胞
。
[0022]作为本申请所述方法的优选实施方式，所述方法包括以下步骤：
[0023]使用第一分化培养基将胚胎干细胞诱导分化至中胚层；使用第二分化培养基对所述中胚层进行下一步诱导分化为心肌中胚层；使用第三分化培养基对心肌中胚层进行下一步诱导分化，获得心肌细胞
。
[0024]作为本申请所述方法的优选实施方式，所述方法包括以下具体步骤：
[0025]1)
向生长状态良好
、
细胞密度达到
90
％以上的胚胎干细胞中加入第一分化培养基培养
24
小时，诱导细胞往中胚层分化；并于诱导培养的第2天至第3天，切换成含有
CPI455
的
RPMI
‑
1640
维持培养基孵育
48
小时，以维持中胚层细胞的状态
。
[0026]2)
在诱导培养的第3天至第4天，将培养基更换为第二分化培养基，诱导细胞往心肌中胚层分化；并于诱导培养的第5天至第6天将培养基更换为含有
CPI455
的
RPMI
‑
1640
维持培养基，孵育
48
小时以维持心肌中胚层细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.KDM5
抑制剂在诱导胚胎干细胞体外定向分化心肌细胞中的应用
。2.
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
KDM5
抑制剂包括
CPI455。3.
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
KDM5
抑制剂配制成诱导分化培养基，在诱导分化培养基中
KDM5
抑制剂的质量浓度为5‑
10
μ
M
，优选地，所述
KDM5
抑制剂的质量浓度为5μ
M。4.
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
KDM5
抑制剂的使用时间为诱导定向分化时间的第0天至第
15
天，优选地，所述
KDM5
抑制剂的使用时间为诱导定向分化时间的第0天至第7天
。5.
一种诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基包括第一分化培养基
、
第二分化培养基和第三分化培养基；所述第一分化培养基包括基础培养基
、5
‑
10
μ
M CPI455
和6μ
M WNT
信号通路激活剂
CHIR99021
；所述第二分化培养基包括基础培养基
、5
‑
10
μ
M CPI455
和
2.5
μ
M WNT
信号通路抑制剂
IWP2
；所述第三分化培养基包括基础培养基
、200
μ
g/mL
抗坏血酸和
10
μ
g/mL
胰岛素
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂焕，李东伟，张冉，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第五医院广州再生医学与健康广东省实验室附属医院，
类型：发明
国别省市：