检测全血、尿中吗啡类生物碱的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析方法技术

本发明专利技术公开了一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析方法，所述ＬＣ－ＭＳ及ＭＳ的条件分别如下：１）ＬＣ－ＭＳ色谱条件：流动相由Ａ、Ｂ组成，其中Ａ为含２ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵和０．０５％（ｖ／ｖ）甲酸的水，Ｂ为含２ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵和０．０５％（ｖ／ｖ）甲酸的乙腈，所述Ａ、Ｂ的体积比为９０∶１０；柱温：４５℃；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；进样量：１０μＬ；２）ＭＳ条件：检测方式：多反应监测ＭＲＭ；扫描方式：正离子扫描；电喷雾电压：３２００Ｖ；雾化气流速：Ｎ２?６００Ｌ／ｈｒ；锥孔反吹气流速：Ｎ２?５０Ｌ／ｈｒ；离子源温度：１０５℃；碰撞气：氩气；内标：吗啡－ｄ３。所述吗啡类生物碱为３－β－Ｄ葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、Ｏ６－单乙酰吗啡和可待因。本发明专利技术采用固相萃取方法对样品进行净化，使定性和定量更准确；采用不同的淋洗和洗脱条件，使所得回收率最高，样品上样后经一步清洗后即用甲醇洗脱，简化了实验步骤，节约了分析时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析方法，具体涉及一种检测全血、尿中3-β -D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡和可待因的LC-MS/MS分析 方法。
技术介绍
随着国际毒潮持续泛滥，境外毒品对我国的侵袭日益加剧，吸食或注射海洛因的 人员也越来越多，因此对人体内吗啡类生物碱的分析检测的要求也越来越高。按照公安部 《对吸食、注射毒品人员成瘾标准界定》的规定，凡查获吸食、注射毒品者，应进行毒瘾司法 鉴定和吸毒违法行为的认定。其中，这两个认定的首位要素就是需要先对涉毒人员的血样 或尿液进行检测。为保证检测的客观性、准确性和及时性，必须了解海洛因在人体内的代谢 过程。一般来说，海洛因在人体内代谢很快，几乎检测不到原体，很快被血脂酶去乙酰化成 O6"单乙酰吗啡，再进一步代谢成去甲吗啡和吗啡。而吗啡的主要代谢途径则是其3位羟 基与葡萄糖醛酸结合，从而使87%的吗啡在72小时内被代谢掉，而其中的75%则被代谢为 3- β -D葡萄糖醛酸吗啡形式。由于该3- β -D葡萄糖醛酸吗啡水溶性强、极性大，提取、检测 都比较困难，因此鲜有文献报道。现有的关于GC-MS分析生物检材中吗啡类生物碱的文献报道，其检材都必须要经 溶剂提取、衍生化等步骤，无法检测生物检材中吗啡与葡萄糖醛酸的结合物-3-β -D葡萄 糖醛酸吗啡，因此不能满足案件检验的需要。近年来，液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术发展迅速，它集液相色谱高效的在 线分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性于一体，正成为法医毒物分析强有力的工具。与 GC/MS相比，应用范围更广，不受被分析物挥发性、极性、热稳定性的限制，也无需衍生化过 程。多反应监测(MRM)模式通过两次离子选择作用，锁定目标物的母离子-子离子对，大大 提高了分析的专一性和灵敏度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的LC-MS/ MS分析方法，具体是提供一种检测全血、尿中3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗 啡和可待因的LC-MS/MS分析方法。本专利技术的LC-MS/MS分析方法，具体如下1.色谱及质谱条件(LC-MS/MS)1)液相色谱(LC-MS)条件色谱柱Xterra MSC18 3. 5 μ m 2. 1 X 150mm(Waters 公司)流动相由A、B组成，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.05% (ν/ν)甲酸的水，B为含 2mmol/L甲酸铵和0.05% (ν/ν)甲酸的乙腈，A、B的体积比为90 10。柱温45°C流速0· 2mL/min进样量10μ L2)质谱(MS)条件检测方式多反应监测(MRM)扫描方式正离子扫描电喷雾电压3200V雾化气流速N2600L/hr锥孔反吹气流速N2 50L/hr离子源温度105°C碰撞气氩气3) MRM 参数每个化合物选取两个母离子_子离子对，结合保留时间定性，峰度强的子离子定量。2.样品处理1)血样全血用纯净水1 l(v/v)稀释后离心上样(16000rpm，5min)。依次用ImL甲醇， ImL水活化oasis HLB柱(lcc/30mg)，精取全血稀释液加入内标lOOng，混勻后上柱，用ImL 含5% (ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脱，整个过程流速控制在约2mL/min。 洗脱液在60°C水浴中空气流下吹干，残渣用100 μ L流动相溶解，转移至自动进样小瓶中进 样，。2)尿样依次用ImL甲醇，ImL水活化oasis HLB柱(lcc/30mg)，精密吸取1.0尿样，加入 内标lOOng，混勻后上柱，用ImL含5% (ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脱，整 个过程流速控制在2mL/min左右。洗脱液在60°C水浴中空气流下吹干，残渣用IOOyL流动 相溶解，转移至自动进样小瓶中进样。其中，固定相为C18。3.结果分析根据色谱图和线性方程，计算各化合物的浓度。相对于现有技术，本专利技术的LC-MS/MS分析方法，具有如下优点1)可以快速的检测出生物检材中吗啡与葡萄糖醛酸的结合物-3_β -D葡萄糖醛酸吗啡。2)采用不同的淋洗和洗脱条件，即用ImL含5% (ν/ν)甲醇的水淋洗，ImL甲醇洗 脱，使所得回收率最高。因此，样品上样后经一步清洗后即用甲醇洗脱，简化了实验步骤，节 约了分析时间。吸食海洛因者的血样通常比较粘稠，为了便于过柱，将全血用纯净水稀释、 离心后上样。3)采用固相萃取方法进行净化，使定性和定量更准确。本专利技术曾分别采用甲醇、乙 腈直接稀释沉淀蛋白进样，但由于溶剂效应，几个成分的色谱峰都集中在2min，无法有效分 离；另外采用这种方法，基质效应影响明显，每个实际样品中各成分出峰时间都有所不同。附图说明图1为实际案件血样中3-β -D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因及 内标的MRM色谱图。具体实施方式 以下结合具体实施例进一步详细描述本专利技术的技术方案。3-β-D葡萄糖醛酸吗啡、内标吗啡-d3购自于Cerilliant公司，吗啡、O6-单乙酰 吗啡、可待因购自于中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均为色谱纯，购自Merck公司，其它试剂均为国产分析纯。Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE 串联四极杆液-质联用仪(美国 Waters 公司),配 MassLynxV4. 1 软件。oasis HLB柱购自美国Waters公司。实施例1血样中3_β-D葡萄糖醛酸吗啡、吗啡、O6-单乙酰吗啡、可待因的检测1.液相色谱条件色谱柱Xterra MSC18 3. 5 μ m 2. 1 X 150mm(Waters 公司)流动相为A和B，其中A为含2mmol/L甲酸铵和0.05% (ν/ν)甲酸的水，B为含 2mmol/L甲酸铵和0.05% (ν/ν)甲酸的乙腈，A、B的体积比为90 10。柱温45°C流速0· 2mL/min进样量10μ L2.质谱条件检测方式多反应监测(MRM)扫描方式正离子扫描电喷雾电压3200V雾化气流速N2600L/hr锥孔反吹气流速N2 50L/hr离子源温度105°C碰撞气氩气内标吗啡-d33. MRM 参数每个化合物选取两个母离子_子离子对，结合保留时间定性，峰度强的子离子定 量，各参数详见表1。 表1各化合物及内标的质谱MRM参数 <table>table see original document page 6</column></row><table>4.样品处理全血用纯净水1 l(v/v)稀释后离心上样(16000rpm，5min)。依次用ImL甲醇， ImL水活化oasis HLB柱(lcc/30mg)，精取全血稀释液加入内标lOOng，混勻后上柱，用ImL 含5% (ν/ν)甲醇的水淋洗柱子，然后用ImL甲醇洗脱，整个过程流速控制在约2mL/min。洗 脱液在60°C水浴中空气流下吹干，残渣用100 μ L初始流动相溶解，转移至自动进样小瓶中 进样。5.结果分析1)最低检测限以峰度弱的子离子峰强度信噪比S/N > 5确定为最低检测限(LOD)，各化合物的 LOD见表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测全血、尿中吗啡类生物碱的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析方法，其特征在于，所述ＬＣ－ＭＳ及ＭＳ的条件分别如下：１）ＬＣ－ＭＳ色谱条件：流动相由Ａ、Ｂ组成，其中Ａ为含２ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵和０．０５％（ｖ／ｖ）甲酸的水，Ｂ为含２ｍｍｏｌ／Ｌ甲酸铵和０．０５％（ｖ／ｖ）甲酸的乙腈，所述Ａ、Ｂ的体积比为９０∶１０；柱温：４５℃；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；进样量：１０μＬ；２）ＭＳ条件：检测方式：多反应监测ＭＲＭ；扫描方式：正离子扫描；电喷雾电压：３２００Ｖ；雾化气流速：Ｎ↓［２］６００Ｌ／ｈｒ；锥孔反吹气流速：Ｎ↓［２］５０Ｌ／ｈｒ；离子源温度：１０５℃；碰撞气：氩气；内标：吗啡－ｄ３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉荣，梁晨，叶海英，汪蓉，
申请(专利权)人：上海市公安局刑事侦查总队，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]