一种抗冻蛋白及其基因制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种抗冻蛋白及其基因序列

【技术实现步骤摘要】
一种抗冻蛋白及其基因、酵母工程菌和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种抗冻蛋白
、
表达抗冻蛋白的工程菌及其构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]科学研究过程中经常会用到细胞冻存技术，细胞在冻存过程中会受到冰晶引起的细胞坏死和凋亡，为了减少这种损伤，我们通常在细胞冻存液中加入甘油
、
乙二醇
、
丙二醇
、
乙酰胺
、
甲醇
、
二甲基亚砜（
DMSO
）等，这些渗透性冷冻保护剂可以使细胞膜明显松弛，使细胞更容易适应低温保存过程中的压力
。
但是由于其具有渗透性因此对细胞具有一定毒性，对于细胞膜蛋白有损害
。
[0003]抗冻蛋白最早是在南极鱼的血液中发现的，随后发现其存在于生活在极地地区的各种生物中，例如鱼类
、
昆虫
、
植物
、
细菌和真菌等
。
抗冻蛋白是一种特殊的大分子蛋白质，它可以特异性地降低溶液的冰点而不影响其熔点，这样冰点与熔点间产生的差值称为热滞活性，从而可以阻止冰核形成，控制冰晶的生长，维持体液的液体状态，在一定程度上提高生物的抗冻能力
。
[0004]长期处于冰雪覆盖下的南极海洋是世界上最严酷的生存环境，但是依然有生物通过在体内产生抗冻蛋白从而实现对这种环境的适应
。
南极鱼中已发现并且经验证具有活性的抗冻蛋白有卵壳蛋白/>ZPC5
，抗冻蛋白
LD4
和钙调素基因，其中体外表达并且纯化的
ZPC5
在体外具有抑制冰晶生长的作用，而
LD4
蛋白和钙调素基因在烟草中过表达后具有提高其低温抵抗力的作用
。
[0005]除了南极鱼，还在昆虫中发现云山卷叶蛾（
Choristoneurafumiferana
）抗冻蛋白（
CfAFP
），其在大肠杆菌表达系统中进行表达，获得的重组蛋白具有显著抑制冰晶生长的作用
。
此外，一种生活在南极的昆虫雪蚤体内也存在高活性的抗冻蛋白，研究者发现其在毫摩尔浓度下的抗冻活性是鱼类抗冻蛋白活性的
10 ~ 100
倍
。
以上研究表明抗冻蛋白不论是在体内还是在体外都有一定的抗寒或者抗冻作用，这种作用使其可以被广泛应用到转基因耐寒作物育种
、
食品冷冻运输
、
细胞的冷冻保存等方面
。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种抗冻蛋白（
HhAFP
）及其编码基因和应用
。
[0007]本专利技术还提供了上述抗冻蛋白的表达系统
、
酵母工程菌以及高效表达抗冻蛋白的方法
。
[0008]本专利技术的技术方案如下：一种抗冻蛋白（
HhAFP
），含有如
SEQ ID No.1
所示的氨基酸序列
。
[0009]SEQ ID No.1:MRVAEVAKVLWVGVCAVAAVTLVVGVQEVVKVVWVVWVWGVQAVVLVVAVVATVVVCFLVVHVVRVVTVCGRVAEVAGVAG。
[0010]优选的，所述的抗冻蛋白，其氨基酸序列如
SEQ ID No.1
所示
。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，所述抗冻蛋白的
C
端还带有
His
标签
。
[0012]所述抗冻蛋白的
N
端还带有1个或2个信号肽切割位点氨基酸
。
信号肽切割位点氨基酸为
KR
或者
R。
[0013]一种抗冻蛋白基因，编码上述抗冻蛋白
。
[0014]优选的，所述抗冻蛋白基因含有 SEQ ID No.2
所示的核苷酸序列
。
[0015]更优选的，所述抗冻蛋白基因的核苷酸序列如
SEQ ID No.2
所示；或者，在其3’
端带有编码
His
标签的核苷酸序列
。
[0016]或者，在其5’
端带有编码1个或2个信号肽切割位点氨基酸的序列
。
优选为
Kex 2
信号肽切割位点；信号肽切割位点氨基酸为
KR
或者
R。
[0017]SEQ ID No.2:atgcgtgttgcagaagtggcaaaagtgctgtgggtgggtgtgtgtgcagtagcagcagtgaccctggtggtgggggtgcaggaggtggtgaaggtggtgtgggtcgtctgggtttggggagttcaggcagttgttcttgttgttgccgtggtggccaccgtggttgtctgctttctggttgttcatgttgttcgtgtcgtgacagtttgtggccgcgtggctgaagttgcaggtgttgccggt。
[0018]所述的抗冻蛋白或抗冻蛋白基因，可用于细胞冷冻保存或者冷冻食品保鲜，所述抗冻蛋白或抗冻蛋白基因可用于制备细胞冷冻保存液
、
冷冻保鲜剂或者冷冻食品
。
所述的抗冻蛋白基因还可用于转基因耐寒植物的育种，培育耐寒植物
。
[0019]一种重组表达载体，含有表达上述抗冻蛋白的基因
。
[0020]优选的，所述的重组表达载体含有表达分泌信号肽的基因
。
在本专利技术的一个优选方案中，所述的重组表达载体采用
pPICZ
α
A
质粒
。
[0021]本专利技术的一个优选方案，所述重组表达载体含有能够表达
SEQ ID No.6
所示蛋白的核苷酸序列
。
[0022]SEQ ID No.6
： 其中双下划线为表分泌信号肽
α
‑
factor
（1‑
83
），波浪线为
Kex 2
信号肽切割位点（
84
‑
85
），单下划线为抗冻蛋白（
HhAFP
）序列（
86
‑
166
），虚下划线代表
His
标签序列
。
[0023]本专利技术的一个优选方案，所述重组表达载体中含有
SEQ ID No. 5
的序列
。
[0024]SEQ ID No. 5
：
atgagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaaca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种抗冻蛋白，其特征在于，含有如
SEQ ID No.1
的氨基酸序列
。2.
根据权利要求1所述的抗冻蛋白，其特征在于，氨基酸序列如
SEQ ID No.1
所示，或者在
SEQ ID No.1
所示序列的
C
端带有
His
标签，或者在
SEQ ID No.1
所示序列的
N
端带有1个或2个信号肽切割位点氨基酸
。3.
一种抗冻蛋白基因，其特征在于，编码权利要求1或2所述的抗冻蛋白
。4.
根据权利要求3所述的抗冻蛋白基因，其特征在于，含有
SEQ ID No.2 所示的核苷酸序列
。5.
一种重组表达载体，其特征在于，含有编码权利要求1或2所述抗冻蛋白的基因
。6.
一种表达抗冻蛋白的酵母工程菌，其特征在于，酵母基因中含有编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈良标，胡瑞芹，许强华，胡鹏，刘明丽，钟文倩，
申请(专利权)人：上海水大技术转移有限公司，
类型：发明
国别省市：