【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，具体涉及一种检测体外血栓溶解的方法。
技术介绍
1、血栓类疾病临床发病率很高且有很高的致残率和致死率，尤其是由血栓栓塞引起的脑卒中、心肌梗死等心脑血管疾病，严重威胁人类健康和生命。血栓形成是在心脏和血管内血液发生凝固或血液中某些有形成分凝集形成固体质块的过程，形成的固体质块称为血栓。目前，公认的血栓形成机制仍与心血管内皮的损伤，血流状态的改变，血液理化性质改变三个因素相关。体外研究所用的血栓严格意义上讲应称为血管外凝血及血凝块，是取动物或人的血液在体外凝结成血块再置于静止状态，或模拟人类血液循环装置中进行研究。
2、体外血栓制备是一种重要的实验方法，被广泛应用于血栓形成和溶解的研究中。通过模拟体内凝血系统的激活过程，体外制备血栓，并对血栓进行荧光标记，可以实时监测血栓的溶解，研究血栓溶解的机制，调控因子以及相关疾病的发生发展进程。然而，现有的检测血栓溶解效果的方法灵敏度不高，检测时间长。
3、因此，亟需提供一种检测体外血栓溶解的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种检测体外血栓检测的方法，该方法的能够实现快速、灵敏地检测体外血栓的溶解情况。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供一种检测体外血栓溶解的方法，该方法包括以下步骤：
3、（1）采用荧光素对纤维蛋白原进行荧光标记，得到荧光素标记纤维蛋白原，将所述荧光素标记纤维蛋白原与血浆混合得到混合液i；
4、（2）
5、（3）将所述体外血栓块、溶栓酶和生理盐水混合进行降解，得到降解后的体外血栓块；
6、（4）测定降解后的体外血栓块中的血栓的结构，分析所述血栓的结构与血栓降解之间的关系；检测降解后的体外血栓块的血浆荧光强度，分析所述血浆荧光强度与血栓降解之间的关系。
7、优选地，步骤（1）中，所述荧光素为fitc和/或tritc。
8、优选地，所述血浆选自鼠的血浆、犬的血浆和人的血浆中的至少一种。
9、优选地，所述荧光素标记纤维蛋白原与所述血浆的体积比为1:3-7。
10、优选地，所述方法还包括：将所述步骤（1）得到的混合液i用生理盐水稀释4-8倍。
11、优选地，步骤（2）中，所述溶剂为缓冲溶液，进一步优选为tris-hcl缓冲溶液。
12、优选地，所述可溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙和硫酸钙中的至少一种，进一步优选为氯化钙。
13、优选地，相对于1ml所述溶剂，所述混合液i添加量为0.8-0.9ml，所述凝血酶的酶活力为0.3-0.6u，所述可溶性钙盐添加量为6-8μmol。
14、优选地，所述孵育的条件至少包括：温度为35-40℃，时间为1-3h。
15、优选地，所述戊二醛溶液中戊二醛的浓度为2-3体积%。
16、优选地，所述固定的条件至少包括：温度为25-30℃，时间为2-4h。
17、优选地，步骤（3）中，所述溶栓酶选自尿激酶、纳豆激酶、链激酶、阿替普酶和瑞替普酶中的至少一种，进一步优选为尿激酶。
18、优选地，相对于1ml所述生理盐水，所述溶栓酶的酶活力为1-2u，所述体外血栓块的用量为0.5-1.0g。
19、优选地，所述降解的条件至少包括：温度为35-40℃，时间为6-24h。
20、优选地，步骤（4）中，采用扫描电镜分析所述血栓的结构；在检测前，在所述降解后的体外血栓块上喷涂6-10nm金属钯。
21、优选地，采用荧光显微镜观察所述血栓的结构。
22、优选地，采用荧光分光光度计检测降解后的体外血栓块的血浆荧光强度。
23、通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
24、本专利技术提供的检测体外血栓溶解的方法，通过荧光素标记纤维蛋白原制备得到体外血栓块，对体外血栓块中的血栓进行荧光标记；将体外血栓块、溶栓酶和生理盐水混合进行降解的过程中，能够根据荧光标记的血栓的结构对血栓的溶解情况快速、灵敏地进行检测。
25、本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
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1.一种检测体外血栓溶解的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述荧光素为FITC和/或TRITC；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光素标记纤维蛋白原与所述血浆的体积比为1:3-7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述步骤（1）得到的混合液I用生理盐水稀释4-8倍。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述溶剂为缓冲溶液，进一步优选为Tris-HCl缓冲溶液；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，相对于1mL所述溶剂，所述混合液I添加量为0.8-0.9mL，所述凝血酶的酶活力为0.3-0.6U，所述可溶性钙盐添加量为6-8μmol；
7.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述戊二醛溶液中戊二醛的浓度为2-3体积%；
8.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述溶栓酶选自尿激酶、纳豆激酶、链激酶、阿替普酶和
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，相对于1mL所述生理盐水，所述溶栓酶的酶活力为1-2U，所述体外血栓块的用量为0.5-1.0g；
10.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，采用扫描电镜分析所述血栓的结构；在检测前，在所述降解后的体外血栓块上喷涂6-10nm金属钯；
...【技术特征摘要】
1.一种检测体外血栓溶解的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述荧光素为fitc和/或tritc；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光素标记纤维蛋白原与所述血浆的体积比为1:3-7。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述步骤（1）得到的混合液i用生理盐水稀释4-8倍。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述溶剂为缓冲溶液，进一步优选为tris-hcl缓冲溶液；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，相对于1ml所述溶剂，所述混合液i添加量为0.8-0.9ml，所述凝血酶的酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴文惠，张冰，张海星，刁小真，韩慧，周游诗琪，
申请(专利权)人：上海水大技术转移有限公司，
类型：发明
国别省市：
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