【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和基因工程，具体涉及一株针对凡纳滨对虾的鳗弧菌减毒菌株的构建及其应用。
技术介绍
1、如今水产养殖业快速发展，但与此同时伴随而来的是对水产业造成危害的病原菌越来越复杂化，一些病原菌繁殖速度快，毒力强，极易于附着在宿主身上，给水产生物造成一系列的疾病。鳗弧菌是海洋、河口常见的革兰氏阴性菌，也是水产养殖动物常见的病原菌。
2、鳗弧菌可感染凡纳滨对虾(litopenaeus vannamei)、中国对虾(fenneropenaeuschinensis)等多种养殖对虾，导致对虾急性肝胰腺坏死。目前防治弧菌病主要依赖抗生素，但抗生素的使用会使弧菌出现耐药性，也会造成水产品的食用安全。
3、溶血素是鳗弧菌分泌的一种胞外蛋白产物，它可以作用于宿主机体的红细胞，导致细胞的损伤，从而红细胞可以将其细胞内的血红蛋白释放出来，对于机体来说出现的症状就是出血性败血症，导致机体的某些部位出现红肿及出血现象。hirono等人(hirono i,masuda t,aoki t.cloning and detection of the hemolysin gene of vibrioanguillarum[j].microb.pathog.1996,21(3):173-182.)通过克隆一段溶血素基因并体外表达蛋白验证，发现了鳗弧菌中第一个溶血素基因vah1。rodkhum等人(rodkhum c,hironoi,crosa j h,et al.four novel hemolysin genes of vibri
4、现有技术中，利用等位基因交换诱变进行基因敲除操作耗时较长，而且通过该方法敲除基因后，毒性降低不明显，因此，需要进一步研究减毒工程菌株的构建方法，对现有技术加以改进，构建毒性更低的鳗弧菌减毒菌株。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中的缺陷和不足，提供一种鳗弧菌减毒菌株及构建方法和应用。
2、一种鳗弧菌减毒菌株，敲除了鳗弧菌溶血素基因vah1和vah4。
3、优选的，一种鳗弧菌减毒菌株(鳗弧菌vibrio anguillarum)，保藏号为cgmccno.27171。2023年4月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
4、上述鳗弧菌减毒菌株，是敲除了vah1基因和vah4基因的鳗弧菌775菌株。
5、上述鳗弧菌减毒菌株可以用于制备鳗弧菌减毒疫苗，或者制备鳗弧菌抗原或抗体。
6、上述鳗弧菌减毒菌株也可以用于建立凡纳滨对虾感染模型，或者筛选治疗鳗弧菌感染的药物。
7、上述鳗弧菌减毒菌株的构建方法，步骤包括：用vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体转化子、鳗弧菌野生株菌液和辅助菌菌液混合后同源重组，得到敲除了vah1基因和vah4基因的鳗弧菌减毒菌株。
8、优选的，步骤为：(a)将vah1敲除重组载体转化子菌液与鳗弧菌野生株菌液和辅助菌菌液混合培养，进行第一次同源重组；筛选得到鳗弧菌减毒菌株△vah1；
9、(b)将vah4敲除重组载体转化子菌液与鳗弧菌减毒菌株△vah1和辅助菌菌液混合培养，进行第二次同源重组，筛选得到敲除了vah1基因和vah4基因的鳗弧菌减毒菌株。
10、优选的，用含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基、以及含蔗糖的培养基培养筛选。
11、所述的辅助菌为含有phelper的转化子。
12、所述的辅助菌为大肠杆菌，vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体转化子的宿主菌为大肠杆菌。
13、优选的，步骤(a)和(b)中，敲除重组载体转化子菌液、鳗弧菌野生株菌液和辅助菌菌液的体积比1:1-5:1-5。
14、vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体转化子的制备方法为：
15、(1)用如seq id no.1-8所示的鳗弧菌溶血素基因vah1、vah4上游同源臂引物up-f、up-r和下游同源臂引物down-f、down-r，扩增vah1、vah4基因上下游同源臂；
16、(2)扩增后的vah1和vah4同源臂分别进行融合pcr，扩增基因的缺失片段，获得vah1同源臂融合片段和vah4同源臂融合片段；
17、(3)同源臂融合片段分别连接到自杀质粒上，构建vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体；
18、(4)用vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体转化宿主菌感受态细胞，经过抗性筛选得到转化子。优选的，所述宿主菌为大肠杆菌。
19、优选的，所述自杀质粒为含有sacb蔗糖筛选基因的质粒载体，用含蔗糖的培养基进行筛选。优选的所述自杀质粒为psr47s。
20、优选的，步骤(1)中扩增引物序列如下。
21、seq id no.1：vah1-up-f cgagctcgccatggagagtggcaatat
22、seq id no.2：vah1-up-r ccatcggctaaccaaccttccaatagcgctgagtgcttttc
23、seq id no.3：vah1-down-f gaaaagcactcagcgctattggaaggttggttagccgatgg
24、seq id no.4：vah1-down-r aaggaaaaaagcggccgcagacttgagccacgtagacc
25、seq id no.5：vah4-up-f cgagctcagtctacttcgtgacgctct
26、seq id no.6：vah4-up-r gcctcacgcttgtttttggagcgtatggttttcatcggc
27、seq id no.7：vah4-down-f gccgatgaaaaccatacgctccaaaaacaagcgtgaggc
28、seq id no.8：vah4-down-r gactagtgtggacccagacgtaaaggt
29、本专利技术的一个优选方案为，通过克隆鳗弧菌溶血素基因vah1和vah4，然后通过酶切连接方式分别构建重组质粒psr47s-vah1和psr47s-vah4，分别转化到大肠杆菌cc118中并筛选重组成功的菌株。借助辅助质粒对供体菌cc118psr47s-vah1和受体菌鳗弧菌野生株进行接合实验，利用抗生素与蔗糖筛选压力获得减毒菌株△vah1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鳗弧菌减毒菌株，其特征在于，敲除了vah1基因和vah4基因。
2.一种鳗弧菌减毒菌株，其特征在于，保藏号为CGMCC NO.27171。
3.根据权利要求2所述的鳗弧菌减毒菌株，其特征在于，是敲除了vah1基因和vah4基因的鳗弧菌775菌株。
4.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在制备鳗弧菌减毒疫苗方面的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在制备鳗弧菌抗原或抗体方面的应用。
6.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在建立凡纳滨对虾感染模型方面的应用。
7.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在筛选治疗鳗弧菌感染的药物方面的应用。
8.权利要求2或3所述鳗弧菌减毒菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：用vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体转化子、鳗弧菌野生株菌液和辅助菌菌液混合后同源重组，得到敲除了vah1基因和vah4基因的鳗弧菌减毒菌株。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，vah1敲除重组载体转化子和vah4敲除重组载体转化子的制备方法为：
...【技术特征摘要】
1.一种鳗弧菌减毒菌株，其特征在于，敲除了vah1基因和vah4基因。
2.一种鳗弧菌减毒菌株，其特征在于，保藏号为cgmcc no.27171。
3.根据权利要求2所述的鳗弧菌减毒菌株，其特征在于，是敲除了vah1基因和vah4基因的鳗弧菌775菌株。
4.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在制备鳗弧菌减毒疫苗方面的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在制备鳗弧菌抗原或抗体方面的应用。
6.权利要求1-3任一项所述的鳗弧菌减毒菌株在建立凡纳滨对虾感染模型方面的应用。
7.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡存洁，姜维，车金远，鲍宝龙，
申请(专利权)人：上海水大技术转移有限公司，
类型：发明
国别省市：
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