【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于外泌体生产，涉及间充质干细胞外泌体的制备，尤其涉及一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法。
技术介绍
1、间充质干细胞在再生医学领域具有重大应用前景，能够用于包括肝，心脏，骨骼，软骨，神经和皮肤在内的多种组织再生和治疗。间充质干细胞分泌的外泌体是一种纳米级的细胞外囊泡，属于间充质干细胞的旁分泌介质之一。
2、间充质干细胞外泌体如今被广泛认为是间充质干细胞发挥生理功能的重要方式，在临床上不仅能增强间充质干细胞的治疗效果，而且在取代干细胞治疗疾病方面也具备巨大的潜力，目前发现间充质干细胞可在体外产生大量外泌体，其可通过特定的信号来调控外泌体的释放，间充质干细胞具备采集方便、增殖能力强和免疫原性低的优势，其分泌的外泌体常被用于再生医学和各种疾病的治疗研究。在间充质干细胞外泌体的研究报道中，其具有低免疫原性、强大的组织修复和免疫调节作用，还拥有更显著的安全性、
3、间充质干细胞外泌体对肾脏和肝脏没有不良影响。其他如全身过敏反应、溶血、热原、血液学指标、血管和肌肉刺激等证据均支持它作为一种安全的治疗介质。还有研究证明，间充质干细胞外泌体可以促进细胞增殖和保护细胞免受过氧化氢诱导的凋亡。外泌体是由大多数细胞类型分泌的内体来源的纳米级细胞外囊泡(evs，30-150nm)。可长距离传播并将其内容物(如核酸、蛋白质)等输送到靶细胞，从而在细胞间通讯中发挥关键作用。然而基于外泌体的疗法的临床转化仍受到严峻挑战，包括可扩展性差的分离方法、有限的产量和纯度。
4、目前，传统的制备外泌体的方法主
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，本专利技术通过将脐带间充质干细胞传代至p3代后，收集上清液备用，采用含0.25％edta的胰蛋白酶消化液收集细胞，按照5-10×106个/ml重悬至上清液中。按照每管5ml的体积，将装载在冻存管中的细胞悬液放置于超低温-80℃冷冻1-2h，37℃解冻，然后收集细胞悬液高速离心4000g，40min，收集上清，经0.22μm滤膜过滤后即可得到脐带间充质干细胞来源的外泌体。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
4、1)将p2代脐带间充质干细胞重悬至完全培养液接种培养瓶中，置于二氧化碳培养箱培养3天后收集，记为p3代脐带间充质干细胞；
5、2)收集步骤1)得到的p3代脐带间充质干细胞培养上清液备用，加入氯化钠注射液清洗培养瓶，采用消化液收集细胞，按照5-10×106个/ml重悬至上清液中，得到细胞悬液；
6、3)步骤2)得到的细胞悬液置于-80℃冷冻；
7、4)步骤3)冷冻后的细胞悬液解冻，高速离心后收集上清，经滤膜过滤后，得到脐带间充质干细胞来源的外泌体。
8、作为本专利技术的一种优选方案，步骤1)中，p2代脐带间充质干细胞的来源为：将脐带组织清洗消毒后，祛除脐带静脉和动脉血管，其余组织剪碎至米粒大小，用氯化钠注射液清洗组织两次；取剪碎后的组织加入胶原蛋白酶，恒温震荡消化；加入氯化钠注射液稀释中止消化，离心，弃去上清，反复两次；取完全培养液重悬沉淀，接种至培养瓶中，记为p0代；继续培养直至细胞生长至瓶底铺满80％以上融合度进行0.25％edta的胰蛋白酶消化传代，收集细胞重悬接种至4个培养瓶，记为p1代；重复，得到p2代脐带间充质干细胞。
9、作为本专利技术的一种优选方案，步骤1)中，p2代脐带间充质干细胞按照0.5～1×105个/ml重悬至完全培养液。
10、作为本专利技术的一种优选方案，步骤1)中，完全培养液为mscbm与5wt％人源血小板裂解液。
11、作为本专利技术的一种优选方案，步骤2)中，消化液为质量比1:2的0.25wt％edta的胰蛋白酶以及0.9wt％氯化钠注射液。
12、作为本专利技术的一种优选方案，步骤3)中，细胞悬液在-80℃下冷冻1-2h。
13、作为本专利技术的一种优选方案，步骤4)中，解冻的温度为37℃。
14、作为本专利技术的一种优选方案，步骤4)中，高速离心的参数为4000g，40min。
15、作为本专利技术的一种优选方案，步骤4)中，滤膜为0.22μm的滤膜。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
17、1)本专利技术制备的间充质干细胞外泌体的方法简单，易于大规模生产，易于工业化。
18、2)本专利技术制备的间充质干细胞外泌体纯度高，活性好。
19、3)本专利技术制备的间充质干细胞外泌体的方法可工业化批量生产。
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1.一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)中，P2代脐带间充质干细胞的来源为：将脐带组织清洗消毒后，祛除脐带静脉和动脉血管，其余组织剪碎至米粒大小，用氯化钠注射液清洗组织两次；取剪碎后的组织加入胶原蛋白酶，恒温震荡消化；加入氯化钠注射液稀释中止消化，离心，弃去上清，反复两次；取完全培养液重悬沉淀，接种至培养瓶中，记为P0代；继续培养直至细胞生长至瓶底铺满80％以上融合度进行0.25％EDTA的胰蛋白酶消化传代，收集细胞重悬接种至4个培养瓶，记为P1代；重复，得到P2代脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)中，P2代脐带间充质干细胞按照0.5～1×105个/mL重悬至完全培养液。
4.根据权利要求1所述的一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)中，完全培养液为MSCBM与5wt％人源血小板裂解液。
<...【技术特征摘要】
1.一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)中，p2代脐带间充质干细胞的来源为：将脐带组织清洗消毒后，祛除脐带静脉和动脉血管，其余组织剪碎至米粒大小，用氯化钠注射液清洗组织两次；取剪碎后的组织加入胶原蛋白酶，恒温震荡消化；加入氯化钠注射液稀释中止消化，离心，弃去上清，反复两次；取完全培养液重悬沉淀，接种至培养瓶中，记为p0代；继续培养直至细胞生长至瓶底铺满80％以上融合度进行0.25％edta的胰蛋白酶消化传代，收集细胞重悬接种至4个培养瓶，记为p1代；重复，得到p2代脐带间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种用于工业化生产间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，步骤1)中，p2代脐带间充质干细胞按照0.5～1×105个/ml重悬至完全培养液。
4.根据权利要求1所述的一种用于...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁冬，金昊，黄炎杰，
申请(专利权)人：杭州源本生物医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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