日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法技术

本发明专利技术涉及林业科学中林木繁殖及植株再生技术，具体地说是一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法。它选取日本落叶松无性系、不同年龄植株１年生的枝条为材料，取其腋芽，经不定茎形成、伸长生长、继代培养等，实现茎器官的再生。本发明专利技术为日本落叶松再生植株的形成提供了一种速度快、周期短、不受季节影响，且具有较高增殖效率的繁殖方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及林业科学中林木繁殖及植株再生技术，具体地说是一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法。
技术介绍
落叶松属松科(Pinaceae)中的落叶松亚科(Laricodeae)，本属种质资源丰富，据资料报道，金世界共有落叶松25个种及若干变种、杂种，其中17种分布在我国(文献1王战(主编)，张颂云(副主编)，1992，中国落叶松林，北京中国林业出版社，pp1-3)。它们分布广，遍及北半球的亚热带山区、温带山区及寒温带平原地区。落叶松具有适应性强、生长速度快、成林早、抗病虫害以及木材强度高、耐腐性强等优良品质，在工业上有广泛的用途并能作为重要的造纸原料。由于落叶松的上述特性，可作为大面积造林树种。日本落叶松(Larix Kaempferi(Lamb)Carr.)原产于日本本州岛中部，迄今已在世界许多国家有了引种栽培，我国最早引种日本落叶松是在1884年，少量种植于青岛崂山。历经百年，引种范围已经扩大到北起黑龙江林口，南至湖南安化，东从青岛崂山，西至新疆哈密，但栽培区域主要集中在辽、吉、鲁、鄂、川、陕、甘等省。70年代和80年代进行的两次落叶松种间对比和日本落叶松种源联合实验表明，在我国降雨量500mm以上的温带山区和亚热带中高山区，日本落叶松同其他同属种相比，如长白落叶松(L.olgensis Henry)、华北落叶松(L.principis-rupprechtii Mayr.)、兴安落叶松(L.gmelini Rupr.)等，具有较大的生长优势(文献2马常耕，王建华，1992，我国发展日本落叶松问题的探讨，落叶松种和种源的选择，北京北京农业大学出版社，pp22-29)。但是由于日本落叶松种子年稀少，结实量少，种子不宜采集和发芽率低等弱点，利用天然的种子远远不能满足生产的需要，因此，人们对其进行了一系列的改良工作。国内日本落叶松的育种工作始于20世纪60年代，基本上经历了种和种源选择试验阶段、种子园阶段和无性系阶段，现已选育出一批具有优良性状的植株，但由于个体数量少，所以难于满足商品林业的需求。上世纪80年代中期，开始无性扦插技术的研究，幼树扦插以取得一定成绩，但成树的扦插问题仍尚未解决。因此，促使人们再探灯新的良种繁育途径。微体繁殖作为现代生物技术的一个重要组成部分，具有速度快、周期短、不受季节影响、后代稳定性高的特点，现已取得了显著成绩，并在农业、林业、医药、遗传育种等方面得到广泛应用。落叶松微体繁殖主要集中于欧洲落叶松(L.decidua Mill.)和欧日杂种落叶松(L.×eurolepis)两个树种上，如Bonga(文献3J.M.Bonga，1982，Shoot formation in callusfrom the stalks of young female strobili of Larix deciduas，Can.J.Bot.，60(8)1357-1359)从欧洲落叶松雌球果部分经愈伤组织形成枝，从幼嫩组织中形成不定芽；最重大的突破是Nagimani(文献4R.Nagmani；J.M.Bonga，1985，Embryo in subcultured callus of Larix deciduas.Can.J.For.Res.，15(6)1088-1091)利用雌配子体诱导形成的欧洲落叶松再生植株，Laliberte和Lalonde(文献5A.Laliberte；M.Lalonde，1988，Sustained caulogenesis incallus cultures of Larix ×eurolepis initiated from short shoot buds of a12-year-old tree，Am.J.Bot.，75(6)767-777)培养的杂种落叶松再生植株，以及Klimaszewska(文献6K.Klimaszewska，1989，Recovery of somaticembryos and plantlets from protoplast cultures of Larix ×eurolepis，Plant CellReports，8(8)440-444)得到的落叶松属中第一个体胚再生植株--杂种落叶松未成熟合子胚的再生植株。上世纪90年代，Ewald(文献7D.Ewald，1998，Advances in tissue culture of adult larch，Vitro Cellular andDevelopmental Biology Plant，34(4)325-330)等在成树的微体繁殖如诱导生根等问题上取得了突破性进展，发现材料在无激素的培养基上连续继代，或微嫁接，可使成年材料恢复幼年性状。迄今，虽然已经在欧洲落叶松的幼树微体繁殖中建立了持续微体繁殖体系，但它们或者繁殖率低，如Itahana利用了日本落叶松的顶芽(文献8N.Itahana，1995，Manual for budculture of Japanese larch，Bulletin of the National Forest Tree Breeding Center，13145-149)，而每个枝条仅有1个顶芽；或者仅注重科学问题，如Klimaszewska利用杂种落叶松进行的原生质体途径再生植株的试验(见文献6)，因此距离生产应用尚有相当距离。目前在我国，对日本落叶松的微体繁殖还没有相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法，它能够提高优良种质材料的增殖效率，满足商品林业生产对优良苗木的数量需求。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下选取不同林龄的日本落叶松无性系1年生枝条为材料，取其腋芽，经不定茎形成、伸长诱导，及继代培养等过程，实现茎器官的再生；具体可按如下步骤操作1)材料的采集及预处理采集时间为入冬至初春芽苞萌动前或萌动时，取样前将枝条水培至芽苞放亮，水温为室温；2)培养基的制备(1)用常规方法制备改良MS、WPM或SH培养基，其中WPM或SH对茎诱导生成效果明显；(2)分装培养基并进行高压蒸汽灭菌，冷却后备用；3)接种腋芽将水培后芽苞发亮的枝条流水洗涤，剪下腋芽，无菌条件下灭菌，WPM或SH作为茎诱导培养基，其中附加植物生长调节物质，培养基中接种腋芽，进行不定茎的生成；其中所剪下的腋芽尺寸为0.5～1cm；4)不定茎的伸长生长将生成的不定茎转接于附加了植物生长调节物质和促进物的改良MS培养基中，培养室温度为22～28℃，光强为2000～3000lux，光/暗周期为14～20h/4～10h，历时25～30天，完成茎器官的再生；其中所述光/暗培养周期以16h/8h为最佳；为诱导生根或保存材料，在步骤4)后可进行继代培养，促进不定茎材料的幼化。本专利技术所述生长调节物质分别为细胞分裂素中的玉米素(Zea)、六苄基嘌呤(BA)，生长素中的萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)和/或吲哚丁酸(IBA)，这些对茎诱导中的抽枝率和茎伸长效果明显；所述促进物为活性炭(AC)；所述附加的植物生长调节物质和促进物用量为BA 0.1～0.5mg/l、Zea0.01～0.5mg/l、NAA 0.01～0.1mg/l、IBA 0.1～0.5mg/l、I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法，其特征在于：选取日本落叶松无性系、不同年龄植株１年生枝条为材料，取其腋芽，经不定茎形成、伸长生长、继代培养等，实现茎器官的再生；具体可按如下步骤操作：１）材料的采集及预处理：采集时间为入冬 至初春芽苞萌动前或萌动时，使用前将枝条水培至芽苞放亮；２）培养基的制备：（１）常规方法制备改良ＭＳ、ＷＰＭ或ＳＨ；（２）分装培养基并进行高压蒸汽灭菌，冷却后备用；３）接种腋芽：将水培后芽苞发亮的枝条流 水洗涤，剪下腋芽，在无菌条件下灭菌，茎诱导培养基中附加植物生长调节物质，在ＷＰＭ或ＳＨ培养基上接种腋芽，进行不定茎的生成；４）不定茎的伸长生长：将生成的不定茎转接于附加了植物生长调节物质和促进物的改良ＭＳ培养基中，控制培养室 温度为２２～２８℃，光强为２０００～３０００ｌｕｘ，光／暗周期为１４～２０ｈ／４～１０ｈ，完成茎器官的再生。

【技术特征摘要】
1.一种日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法，其特征在于选取日本落叶松无性系、不同年龄植株1年生枝条为材料，取其腋芽，经不定茎形成、伸长生长、继代培养等，实现茎器官的再生；具体可按如下步骤操作1)材料的采集及预处理采集时间为入冬至初春芽苞萌动前或萌动时，使用前将枝条水培至芽苞放亮；2)培养基的制备(1)常规方法制备改良MS、WPM或SH；(2)分装培养基并进行高压蒸汽灭菌，冷却后备用；3)接种腋芽将水培后芽苞发亮的枝条流水洗涤，剪下腋芽，在无菌条件下灭菌，茎诱导培养基中附加植物生长调节物质，在WPM或SH培养基上接种腋芽，进行不定茎的生成；4)不定茎的伸长生长将生成的不定茎转接于附加了植物生长调节物质和促进物的改良MS培养基中，控制培养室温度为22～28℃，光强为2000～3000lux，光/暗周期为14～20h/4～10h，完成茎器官的再生。2.根据权利要求1所述日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法，其特征在于为诱导生根或保存材料，在步骤4)后可进行继代培养，促进不定茎材料的幼化。3.根据权利要求1所述日本落叶松微体繁殖的茎诱导方法，其特征在于所述生长调...

【专利技术属性】
技术研发人员：王力华，贺凤美，许思明，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]