鉴定非致幻性化合物的GPCR筛选方法技术

提供了新的荧光生物传感器，其用于检测配体诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)的致幻构象变化、检测致幻化合物、检测非致幻性抗抑郁化合物、测量化合物的致幻潜能、测量化合物抗精神病潜能的方法及其适配的试剂盒。病潜能的方法及其适配的试剂盒。病潜能的方法及其适配的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴定非致幻性化合物的GPCR筛选方法
相关申请的交叉引用本申请要求2020年10月13日提交的第63/091,041号美国临时申请和2021年4月30日提交的美国临时申请号63/182,669的优先权，两者均出于所有目的全部并入本文。关于根据联邦资助的研发下作出的专利技术权利的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的第R01GM128997和U01NS013522号资助下，由政府支持进行的。政府对本专利技术拥有一定权利。专利技术背景G蛋白偶联受体(GPCR)感知配体分子结构的微小差异，并将其转化为蛋白质构象集合，具有与药物发现相关的明显功能效果。血清素2A受体(5
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HT2AR)是一个很好的例子，它是非典型抗精神病药、经典致幻剂和促进神经可塑性的心理塑性剂的靶点。目前缺乏能够直接评估5
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HT2AR构象的工具。在此，我们报告了开发psychLight——一种基因编码的荧光生物传感器，其能够报告配体诱导的5
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HT2AR致幻构象。使用表达psychLight的稳定细胞系，我们能够预测几种新型化合物的致幻潜力，并鉴定具有促进神经可塑性和持久抗抑郁特性的非致幻性、迷幻剂激发性的小分子。此外，psychLight允许以毫秒分辨率对自由行为小鼠的皮质和皮质下血清素动力学进行成像。此处描述的致幻剂传感器将能够快速识别滥用的策划药，并促进更安全的下一代神经疗法的开发。所有FDA批准的药物中有大约35％靶向GPCR，因为这些受体与各种疾病有关，并且可以很容易地通过小分子控制。由于GPCR能够通向极多的构象状态，因此可以通过G蛋白、捕获子(arrestin)或其他依赖于配体稳定的特定构象集合的效应子激活许多典型和非典型信号通路。因此，与同一GPCR结合的两个配体可以引发完全不同的功能效应
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这种现象称为功能选择性或偏倚激动。最近的药物发现工作试图利用功能选择性的差异来鉴定副作用较少的药物。当前用于评估功能选择性的技术依赖于测量特定蛋白质(例如，β
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捕获子)的募集或下游信号分子(例如，cAMP)的积累。很少(即使有)直接探测负责产生特定效应的GPCR的构象状态。此外，缺乏以高通量方式测量非典型的功能选择性的方法，并且上述方法都不适合在体内使用。最近，我们报道了一种基于GPCR结构创建基因编码的荧光传感器的模块化策略。在此，我们应用这种策略开发了一种荧光生物传感器，能够检测血清素2A受体(5
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HT2AR)的致幻构象。5
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HT2AR的配体是表现出偏倚激动作用的最早的一些小分子。自该初步报告以来，5
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HT2A配体已被证明通过5
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HT2A单体和异二聚体与多种信号转导途径偶联，导致不同的转录组谱和行为效应。此外，5
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HT2AR配体代表了神经精神病学中一些最重要的药物，包括氯氮平等非典型抗精神病药、麦角酸二乙酰胺(LSD)等致幻剂、以及被称为心理塑性剂(psychoplastogen)的促进神经可塑性的化合物。致幻剂是一类被作为潜在药物重新研究的心理塑性剂，因为它们在治疗抑郁症、创伤后应激障碍(PTSD)和物质使用障碍(SUD)等疾病方面的临床疗效已有悠久历史。5
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HT2AR已被证明可以介导迷幻剂的致幻和心理重塑作用；然而，目前尚不清楚这两者是否对
这些药物的治疗效果都是必需的。最近使用亚致幻剂量和非致幻同系物的啮齿动物研究表明，5
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HT2A配体的致幻作用可能不是产生积极行为结果所必需的。此外，我们最近报道了5
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HT2A配体的致幻作用和心理重塑作用可以通过仔细的化学设计来解耦。鉴于5
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HT2A配体在医学中的重要性以及开发致幻潜力的细胞测定的迫切需求，我们使用5
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HT2AR的结构设计了一种基于荧光的致幻剂传感器，称为psychLight。使用psychLight，我们能够识别出新的滥用致幻药物以及具有类似于致幻性迷幻剂的促神经可塑性和抗抑郁特性的非致幻化合物。最后，由于psychLight对血清素(5
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HT)表现出高度敏感性，我们能够使用它来探测在恐惧条件反射期间自由行为的小鼠的大脑区域特异性5
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HT释放。我们的研究结果不仅表明psychLight可以用于高空间和时间精度的5
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HT的体内检测，而且对于策划致幻剂的鉴定以及用于治疗神经精神疾病的安全有效的下一代药物也具有重要意义。专利技术简述在一种实施方式中，本专利技术提供了一种检测配体诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)致幻构象变化的方法，所述方法包括：在使所述配体与荧光生物传感器结合的条件下，将所述配体与所述荧光生物传感器接触，其中所述荧光生物传感器包括所述GPCR和集成到所述GPCR第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和测量所述生物传感器的荧光变化，从而检测所述的构象变化。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种检测致幻化合物的方法，所述方法包括：在使化合物与荧光生物传感器结合的条件下，将所述化合物与所述荧光生物传感器接触，其中所述荧光生物传感器包括G蛋白偶联受体(GPCR)和集成到所述GPCR第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和测量所述生物传感器的荧光变化，从而检测所述致幻化合物，其中荧光增加表示存在致幻化合物。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种检测非致幻性抗抑郁化合物的方法，所述方法包括：在使化合物与荧光生物传感器结合的条件下，将所述化合物与所述荧光生物传感器接触，其中所述荧光生物传感器包括G蛋白偶联受体(GPCR)和集成到所述GPCR第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和测量所述生物传感器的荧光变化，从而检测所述非致幻性抗抑郁化合物，其中荧光减少表示存在非致幻性抗抑郁化合物。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种荧光生物传感器，其包括：5
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HT2A受体；和结合于5
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HT2A受体的第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种荧光生物传感器，其包括：5
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HT2A受体；其结合于5
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HT2A受体的第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和C端的ER输出肽。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种测量化合物致幻潜能的方法，所述方法包括将所述化合物与本专利技术的荧光生物传感器接触，以及测量所述化合物对所述荧光生物传感器的激动剂作用。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种测量化合物抗精神病潜能的方法，所述方法包括将所述化合物与本专利技术的荧光生物传感器接触，以及测量所述化合物对所述荧光生物传感器的激动剂或拮抗剂作用。在另一种实施方式中，本专利技术提供了一种从非致幻化合物中识别致幻化合物的方
法，所述方法包括：在激动剂条件下，将化合物与荧光生物传感器接触并测量所述化合物的第一荧光信号，其中与第一对照相比，第一荧光信号的增加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测配体诱导的G蛋白偶联受体(GPCR)致幻构象变化的方法，所述方法包括：在使所述配体与荧光生物传感器结合的条件下，将所述配体与所述荧光生物传感器接触，其中所述荧光生物传感器包括所述GPCR和集成到所述GPCR第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和测量所述生物传感器的荧光变化，从而检测所述的构象变化。2.如权利要求1所述的方法，其中所述GPCR为5
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HT受体。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述GPCR为5
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HT2A受体。4.如权利要求3所述的方法，其中所述cpGFP插入于所述5
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HT2A受体的Lys
263
和Ser
316
之间。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述5
‑
HT2A包括多肽LSSGY
‑
cpGFP
‑
MHDQL(SEQ ID NO:49)。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述多肽LSSGY
‑
cpGFP
‑
MHDQL(SEQ ID NO:49)插入于所述5
‑
HT2A受体的Lys
263
和Ser
316
之间。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中跨膜螺旋5(TM5)包括点突变E264Q。8.如权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中跨膜螺旋6(TM6)包括Ser
316
缺失。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中细胞内环2(ICL2)包括点突变Ile
181A
。10.如权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中所述cpGFP包括GCaMP6。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中所述荧光生物传感器在C端进一步包含ER输出肽。12.如权利要求11所述的方法，其中所述ER输出肽为FCYENEV。13.一种检测致幻化合物的方法，所述方法包括：在使化合物与荧光生物传感器结合的条件下，将所述化合物与所述荧光生物传感器接触，其中所述荧光生物传感器包括G蛋白偶联受体(GPCR)和集成到所述GPCR第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和测量所述生物传感器的荧光变化，从而检测所述致幻化合物，其中荧光增加表示存在致幻化合物。14.如权利要求13所述的方法，其中所述GPCR为5
‑
HT受体。15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述GPCR为5
‑
HT2A受体。16.如权利要求15所述的方法，其中所述cpGFP插入于所述5
‑
HT2A受体的Lys
263
和Ser
316
之间。17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述5
‑
HT2A包括多肽LSSGY
‑
cpGFP
‑
MHDQL(SEQ ID NO:49)。18.如权利要求15
‑
17中任一项所述的方法，其中所述多肽LSSGY
‑
cpGFP
‑
MHDQL(SEQ ID NO:49)插入于所述5
‑
HT2A受体的Lys
263
和Ser
316
之间。19.如权利要求15
‑
18中任一项所述的方法，其中跨膜螺旋5(TM5)包括点突变E264Q。20.如权利要求15
‑
19中任一项所述的方法，其中跨膜螺旋6(TM6)包括Ser
316
缺失。21.如权利要求15
‑
20中任一项所述的方法，其中细胞内环2(ICL2)包括点突变Ile
181A
。22.如权利要求13
‑
16中任一项所述的方法，其中所述cpGFP包括GCaMP6。23.如权利要求13
‑
22中任一项所述的方法，其中所述荧光生物传感器在C端进一步包
含ER输出肽。24.如权利要求23所述的方法，其中所述ER输出肽为FCYENEV。25.一种检测非致幻性抗抑郁化合物的方法，所述方法包括：在使化合物与荧光生物传感器结合的条件下，将所述化合物与所述荧光生物传感器接触，其中所述荧光生物传感器包括G蛋白偶联受体(GPCR)和集成到所述GPCR第三细胞内环(IL3)中的环状排列绿色荧光蛋白(cpGFP)；和测量所述生物传感器的荧光变化，从而检测所述非致幻性抗抑郁化合物，其中荧光减少表示存在非致幻性抗抑郁化合物。26.如权利要求25所述的方法，其中所述GPCR为5
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HT受体。27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述GPCR为5
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HT2A受体。28.如权利要求27所述的方法，其中所述cpGFP插入于所述5
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HT2A受体的Lys
263
和Ser
316
之间。29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述5
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HT2A包括多肽LSSGY
‑
cpGFP
‑
MHDQL(SEQ ID NO:49)。30.如权利要求27
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29中任一项所述的方法，其中所述多肽LSSGY
‑
cpGFP
‑
MHDQL(SEQ ID NO:49)插入于所述5
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HT2A受体的Lys
263
和Ser
316
之间。31.如权利要求27
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30中任一项所述的方法，其中跨膜螺旋5(...

【专利技术属性】
技术研发人员：C东，C，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：