荧光生物传感器和用于检测细胞信号转导事件的方法技术

本公开涉及荧光生物传感器及其使用方法。特别地，本文提供了遗传编码的荧光指示剂(GEFI)，其包含环状排列荧光蛋白(cpFP)和与cpFP结合的抑制性分子。在基础状态下，抑制性分子阻止来自环状排列荧光蛋白的荧光。在构象变化和/或抑制性分子和cpFP之间的键断裂时，使得cpFP抑制解除，从而允许来自cpFP的荧光。本文所述的生物传感器可以用于检测多种细胞信号转导事件的方法中。信号转导事件的方法中。信号转导事件的方法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】荧光生物传感器和用于检测细胞信号转导事件的方法
[0001]关于相关申请的声明
[0002]本申请要求于2021年2月26日提交的美国临时专利申请号63/154,006的优先权，出于所有目的其全部内容通过引用并入本文中。


[0003]本公开涉及荧光生物传感器及其使用方法。特别地，本文提供了遗传编码的荧光指示剂(GEFI)，其包含环状排列荧光蛋白(circular
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permuted fluorescent protein)(cpFP)和与cpFP结合的抑制性分子。在基础状态下，抑制性分子阻止环状排列荧光蛋白发出荧光。在构象变化和/或抑制性分子和cpFP之间的键断裂时，使得cpFP抑制解除，从而允许从cpFP发出荧光。本文所述的生物传感器可以用于检测多种细胞信号转导事件的方法中。

技术介绍

[0004]细胞信号转导和蛋白质
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蛋白质相互作用(PPI)在生命系统中是必不可少的。由于它们的重要性，已经开发了许多工具来检测细胞信号转导事件。然而，仍然缺乏检测G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导和蛋白酶切割事件的遗传编码方法。

技术实现思路

[0005]在一些方面，本文提供了遗传编码的荧光指示剂(GEFI)。在一方面，本文提供了包含环状排列荧光蛋白(cpFP)和与cpFP结合的抑制性分子的GEFI。在一些实施方式中，在基础状态下，抑制性分子抑制cpFP发出荧光。在一些实施方式中，在GEFI的构象变化和/或cpFP与抑制性分子之间的键断裂时cpFP荧光抑制解除。<br/>[0006]在一些实施方式中，与cpFP结合的抑制性分子是纳米抗体。例如，纳米抗体可以是Nb39。在一些实施方式中，抑制性分子通过接头与cpFP结合。例如，抑制性分子可以通过接头LKEDI(SEQ ID NO:4)与cpFP结合。
[0007]在一些实施方式中，cpFP与蛋白质结合。例如，cpFP可以与G蛋白偶联受体(GPCR)结合。在一些实施方式中，cpFP与GPCR的C末端结构域结合。在一些实施方式中，GPCR是阿片受体(opioid receptor)。例如，阿片受体可以是μ
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阿片受体、κ
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阿片受体、δ
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阿片受体或嵌合阿片受体。例如，在一些实施方式中，阿片受体是包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的κ
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阿片受体。作为另一实例，在一些实施方式中，阿片受体是包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的嵌合阿片受体。
[0008]在一些实施方式中，cpFP通过接头与蛋白质结合。例如，cpFP可以通过接头FPLKMRMERQGAP(SEQ ID NO:5)与蛋白质结合。作为另一实例，cpFP可以通过接头GAP与蛋白质结合。
[0009]在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序
列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:18具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:27具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:28具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
[0010]本文还提供了编码本文所述GEFI的构建体。
[0011]在一些方面，本文提供了包含本文所述GEFI的细胞。
[0012]在一些方面，本文提供了包含本文所述GEFI的试剂盒。
[0013]在一些方面，本文所述的GEFI、构建体、细胞或试剂盒可以用于检测蛋白酶活性、检测蛋白质
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蛋白质相互作用或检测GPCR激动剂的方法中。
[0014]另一方面，本文提供了确定药剂是否为G蛋白偶联受体(GPCR)激动剂的方法。在一些实施方式中，方法包括提供包括遗传编码的荧光指示剂(GEFI)的系统，其中，该GEFI包括G蛋白偶联受体(GPCR)、环状排列荧光蛋白(cpFP)和抑制性分子。在一些实施方式中，GPCR的C末端结构域与cpFP结合，而cpFP与抑制性分子结合。该方法还包括向系统中加入剂，并在加入剂后检测荧光信号的存在或不存在。在一些实施方式中，在基础状态下，抑制性分子抑制cpFP发出荧光。在一些实施方式中，如果在加入剂后检测到荧光信号，则该剂被鉴定为GPCR激动剂。系统可以包括细胞。
[0015]在一些实施方式中，抑制性分子是纳米抗体。例如，纳米抗体可以是Nb39。在一些实施方式中，抑制性分子通过接头与cpFP结合。例如，接头可以包括序列LKEDI(SEQ ID NO:4)。
[0016]在一些实施方式中，GPCR是阿片受体。例如，阿片受体可以是μ
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阿片受体、κ
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阿片受体或嵌合阿片受体。
[0017]在一些实施方式中，cpFP通过接头与GPCR的C末端结合。在一些实施方式中，接头包括FPLKMRMERQGAP(SEQ ID NO:5)。在一些实施方式中，cpFP通过接头GAP与蛋白质结合。
[0018]在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:17具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，GEFI包括与SEQ ID NO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种遗传编码的荧光指示剂(GEFI)，包含：a.环状排列荧光蛋白(cpFP)，和b.与所述cpFP结合的抑制性分子，其中，抑制性分子抑制处于基础状态的所述cpFP的荧光，并且，其中在所述GEFI的构象变化和/或所述cpFP与所述抑制性分子之间的键断裂时所述cpFP荧光抑制解除。2.根据权利要求1所述的GEFI，其中，与所述cpFP结合的所述抑制性分子是纳米抗体。3.根据权利要求2所述的GEFI，其中，所述纳米抗体包括Nb39。4.根据前述权利要求中任一项所述的GEFI，其中，所述抑制性分子通过接头与所述cpFP结合。5.根据权利要求4所述的GEFI，其中，所述接头包括LKEDI(SEQ ID NO:4)。6.根据前述权利要求中任一项所述的GEFI，其中，所述cpFP与蛋白质结合。7.根据权利要求6所述的GEFI，其中，所述cpFP与G蛋白偶联受体(GPCR)结合。8.根据权利要求7所述的GEFI，其中，所述cpFP与所述GPCR的C末端结构域结合。9.根据权利要求6
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8中任一项所述的GEFI，其中，所述GPCR是阿片受体。10.根据权利要求9所述的GEFI，其中，所述阿片受体是μ
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阿片受体、κ
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阿片受体或嵌合阿片受体。11.根据权利要求10所述的GEFI，其中，所述阿片受体是包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的κ
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阿片受体。12.根据权利要求10所述的GEFI，其中，所述阿片受体是包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列的嵌合阿片受体。13.根据权利要求6
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12中任一项所述的GEFI，其中，所述cpFP通过接头与所述蛋白质结合。14.根据权利要求13所述的GEFI，其中，所述接头包括FPLKMRMERQGAP(SEQ ID NO:5)或GAP。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的GEFI，其中，所述GEFI包括与SEQID NO:17具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。16.根据权利要求15所述的GEFI，其中，所述GEFI包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列。17.根据权利要求1
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14中任一项所述的GEFI，其中，所述GEFI包括与SEQID NO:21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。18.根据权利要求17所述的GEFI，其中，所述GEFI包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列。19.根据权利要求1
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14中任一项所述的GEFI，其中，所述GEFI包括与SEQID NO:18具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。20.根据权利要求19所述的GEFI，其中，所述GEFI包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列。21.根据权利要求1
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14中任一项所述的GEFI，其中，所述GEFI包括与SEQID NO:27具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。22.根据权利要求21所述的GEFI，其中，所述GEFI包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。23.根据权利要求1
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14中任一项所述的GEFI，其中，所述GEFI包括与SEQID NO:28具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。24.根据权利要求23所述的GEFI，其中，所述GEFI包括权利要求31的氨基酸序列。
25.一种构建体，其编码前述权利要求中任一项所述的GEFI。26.一种细胞，其包含前述权利要求中任一项所述的GEFI。27.一种试剂盒，其包含前述权利要求中任一项所述的GEFI。28.根据前述权利要求中任一项所述的GEFI、权利要求26所述的细胞或权利要求27所述的试剂盒在检测蛋白酶活性、检测蛋白质
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蛋白质相互作用或检测样品中G蛋白偶联受体激动剂的方法中的用途。29.一种确定剂是否为G蛋白偶联受体(GPCR)激动剂的方法，包括：a.提供包含遗传编码的荧光指示剂(GEFI)的系统，其中所述GEFI包括G蛋白偶联受体(GPCR)、环状排列荧光蛋白(cpFP)和抑制性分子，其中所述GPCR的C末端结构域与所述cpFP结合，并且其中所述cpFP与所述抑制性分子结合；b.向所述系统添加剂，以及c.加入所述剂后检测荧光信...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文静，凯拉，
申请(专利权)人：密执安大学评议会，
类型：发明
国别省市：