UdgX-SSBE3蛋白及其捕获特定核酸的方法技术

本发明专利技术涉及特定核酸结合蛋白的融合蛋白及其捕获特定核酸的方法。所述融合蛋白由胞嘧啶碱基编辑器和尿嘧啶结合蛋白融合而成，所述方法是从样品中捕获含特定靶标序列DNA（含PAM且在特定位置含胞嘧啶C）的方法，包括：1）将含有所述目标DNA的样品与UdgX

【技术实现步骤摘要】
UdgX
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SSBE3蛋白及其捕获特定核酸的方法


[0001]本文涉及目标核酸的捕获方法。具体而言，本文涉及使用UdgX
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SSBE3蛋白捕获目标核酸的方法和用途。

技术介绍

[0002]目前存在多种从多核苷酸样品(例如在全基因组中)捕获目标核酸的方法和应用。由于复杂DNA样品的影响(例如影响信噪比)，不利于目的序列的特异性识别，需要对目的序列进行捕获。在研究工作中，利用基因捕获探针对特定的区域进行捕获，对该区域设计一定长度的探针序列，每个序列沿着基因位置移动一定距离，然后采用人工合成的方式大量合成上述序列对捕获出的DNA产物进行测序(Calvo SE,Compton AG,Hershman SG,et al.Molecular diagnosis of infantile mitochondrial disease with targeted next
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generation sequencing.Sci Transl Med,2012,4(118):118
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110)。目前用于特定核酸捕获的方法涉及多个步骤，需要使用大量核酸样品，同时捕获过程繁琐、困难、费时费力、准确性低、成本高，需要贵重仪器设备。例如靶向DNA杂交捕获技术需要设计长度超过100bp的特异性单链DNA，在特定条件下与样品核酸进行复杂的长达十几小时的杂交过程甚至更长。而长时间的杂交孵育明显影响捕获的进程。另外，较高的孵育温度以及长时间的孵育将会影响混合液中的盐离子浓度，尤其是当杂交反应的体积较小的时候。例如现有的固相或液相靶向DNA杂交捕获技术的目标DNA捕获率只能达到～400倍(Enrichment of sequencing targets from the human genome by solution hybridization.Ryan Tewhey,Masakazu Nakano,XiaoyunWang,Carlos Barbara Novak,Angelica Giuffre,Eric Lin,Scott Happe,Doug N Roberts,Emily M LeProust,Eric J Topol,Olivier Harismendy and Kelly A Frazer.Genome Biol.2009；10(10):R116.doi:10.1186/gb
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2009
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r116)和～1000倍(Microarray
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based genomic selection for high
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throughput resequencing.David T Okou,Karyn Meltz Steinberg,Christina Middle,David J Cutler,Thomas J Albert&Michael E Zwick.Nat Methods.2007Nov；4(11):907
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9)。而且这一过程成本高、特异性低、DNA捕获效率低，而且捕获效果受人员实验技术影响巨大，无法实现自动化。因此需要开发快速、高效、低成本的特定核酸捕获新方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术首先提供一种融合蛋白，其由胞嘧啶碱基编辑器和尿嘧啶结合蛋白融合而成，所述胞嘧啶碱基编辑器为UdgX，所述尿嘧啶结合蛋白为BE3编辑器，或其优化的SSBE3编辑器。
[0004]所述尿嘧啶结合蛋白为UdgX蛋白来自M.smegmatis,M.avium,R.imtechensis，M.haemophilum,Rhodococcusspp,Streptomycescoelicolor,Gordonianamibiense,Bradyrhizobiumjaponicum和Nocardia farcidia。更具体地，其氨基酸序列如SEQ ID No.22所示。
[0005]所述胞嘧啶碱基编辑器为胞嘧啶碱基编辑器是BE3型编辑器，或经优选的BE3型编辑器，具体地优选为后BE3型编辑器是SSBE3，其氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
[0006]尿嘧啶结合蛋白和胞嘧啶碱基编辑器两者之间通过linker连接，优选地，linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。一个具体实施方式中，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]在一些实施方案中，融合蛋白包括的UdgX中具有基序A(GEQPG)和基序B(HPSSLL)的序列，并且包含保守区KRRIH。在一些实施方案中，融合蛋白可以是包含SEQ ID No.1的序列或SEQ ID No.2编码的氨基酸序列或由其组成的蛋白或其变体。
[0008]在一些实施方案中，融合蛋白可以是包含与SEQ ID No.1的序列或SEQ ID No.2编码的氨基酸序列具有约60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％以上或100％同一性的氨基酸序列或由其组成的蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白的变体与融合蛋白相比在一个或多个位点具有一个或多个非天然氨基酸，一个或多个氨基酸置换，一个或多个氨基酸插入，一个或多个氨基酸缺失，或其任意组合。在一些实施方案中，所述变体与融合蛋白具有基本上类似或可比的活性。在一些实施方案中，UdgX
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SSBE3蛋白的变体与融合蛋白的氨基酸序列可以具有约60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％以上的序列同一性。如本领域技术人员已知的，可以通过在制备重组蛋白时引入氨基酸的保守置换、缺失和添加获得蛋白的变体。也可以通过改变编码序列的特定密码子提供所需的置换，缺失或插入。另外，也可以通过随机或饱和诱变技术如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链反应诱变和寡核苷酸引导的诱变制备蛋白变体。在一些实施方案中，保守置换包括类似性质氨基酸之间的置换，例如疏水氨基酸Nle，Met，Ala，Val，Leu，Ile之间的置换，中性亲水的氨基酸Cys，Ser，Thr，Asn，Gln之间的置换，酸性的氨基酸Asp，Glu之间的置换，碱性氨基酸His，Lys，Arg之间的置换，影响链取向氨基酸Gly，Pro之间的置换，和芳族氨基酸Trp，Tyr，Phe之间的置换。在一些实施方案中，可以包括上述类型之间的非保守性置换。
[0009]在一些实施方案中，所述融合蛋白还具有纯化标签，从而有利于容易地进行分离和/或纯化。在一些实施方案中，可以使用的纯化标签包括Snap
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tag、His
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tag、Flag
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tag、MBP
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tag、生物素等常用于蛋白纯化的标签。
[0010]由此本专利技术也提供编码上述融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其由胞嘧啶碱基编辑器和尿嘧啶结合蛋白融合而成；更优选地，优选地，所述尿嘧啶结合蛋白为UdgX，具体地，其UdgX中包括基序A：GEQPG和基序B：HPSSLL的序列，并且包含保守区KRRIH；更具体地，所述尿嘧啶结合蛋白UdgX蛋白来自M. smegmatis,M. avium, R.imtechensis，M.haemophilum, Rhodococcusspp, Streptomycescoelicolor, Gordonianamibiense, Bradyrhizobiumjaponicum和Nocardia farcidia；更优选地，其氨基酸序列如SEQ ID No.22所示；所述胞嘧啶碱基编辑器为BE3编辑器（例如识别的pam类型不同的VQR
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BE3,VRER
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BE3，EQR
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BE3等），aid编辑器，或其优化的SSBE3编辑器；胞嘧啶碱基编辑器和尿嘧啶结合蛋白两者通过linker连接后，具体的linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还具有纯化标签，从而有利于容易地进行分离和/或纯化；具体地，所述纯化标签包括Snap
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tag、His
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tag、Flag
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tag、MBP
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tag、生物素用于蛋白纯化的标签。4.编码如权利要求1至3任一项所述融合蛋白的多核苷酸，表达载体和重组宿主细胞，特别具体地，所述多核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。5.一种从样品中捕获目标DNA的方法，所述方法包括：1）将含有具有PAM且在特定位置含胞嘧啶C的靶标序列DNA的样品与其靶向sgRNA以及如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白接触，例如混合，以获得融合蛋白
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目标DNA复合物；2）回收富集的靶标序列DNA，优选地，其中所述靶标序列DNA为双链DNA或者单链DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：王猛，潘文嘉，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：