一种重组蛋白及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开一种具有β

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新的具有木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶及葡糖苷酶活性的重组蛋白及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生生物质原料，其高效转化对于缓解能源和环境危机具有重要意义。在木质纤维素的高值化利用中，酶解转化具有特异性高、副产物少、条件温和及环境友好等优势。将木质纤维素中的纤维素、半纤维素充分糖化以获得高浓度的可发酵糖是整个生物质转化过程中的关键，也是众多研究者广泛关注的问题。而在整个糖化过程中，包括β
‑
木糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶及阿拉伯呋喃糖苷酶在内的糖苷酶是整个木质纤维素水解酶系中最为关键的酶类，决定着木质纤维素最终水解产物中可利用单糖的含量。
[0003]由于木质纤维素组分的异质性和结构的复杂性，其水解往往需要多种水解酶的协同参与。因此大量研究通过组配不同的水解酶来协同水解木质纤维素底物，但不同水解酶之间很难达到理想的协同效果。近年来，越来越多的研究发现自然进化而来的多功能酶能够同时催化两种或两种以上的反应，可以利用分子内部的协同作用来木质纤维素的降解，比多个游离酶之间的组配表现出更高的催化效率，并且能够克服不同来源的酶在水解条件上的不匹配性。因此，开发同时具有β
‑
木糖苷酶、β
‑
葡糖苷酶及阿拉伯呋喃糖苷酶等活性的多功能酶能够有效提高木质纤维素的水解效率，推动生物质的炼制。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本专利技术提供了一种同时具有β
‑
木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶及β
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葡糖苷酶活性的重组蛋白或其功能性片段，及其编码基因和应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种重组蛋白，其包括对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第109位至第544位的氨基酸序列，或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。
[0006]在一些实施方式中，所述重组蛋白可以包括与对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第109位至第544位的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0007]在一些实施方式中，所述重组蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性序列同一性的氨基酸序列。
[0008]在一些实施方式中，所述重组蛋白还可以包括在位于N端或C端的标签。
[0009]在一些实施方式中，所述标签可以包括，但不限于，一个或多个Arg标签、His标签、Flag标签、GST标签、Myc标签、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA标签、Strep
‑
tagⅡ、SUMO标签等。部分标签的序列如下表1所示。
[0010]表1标签的序列
[0011]标签残基序列Poly
‑
Arg5
‑
6个(优选为5个)RRRRR(SEQ ID NO:5)Poly
‑
His2
‑
10个(优选为6个)HHHHHH(SEQ ID NO:6)FLAG8个DYKDDDDK(SEQ ID NO:7)Strep
‑
tagⅡ8个WSHPQFEK(SEQ ID NO:8)c
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myc10个EQKLISEEDL(SEQ ID NO:9)
[0012]在一些实施方案中，所述重组蛋白来源于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。
[0013]本公开的重组蛋白同时具有β
‑
木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶及β
‑
葡糖苷酶活性。
[0014]第二方面，本专利技术提供编码所述重组蛋白的核酸。
[0015]在一些实施方案中，编码所述重组蛋白的核酸包括对应于SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的从5
’
端第327位至第1632位的核苷酸序列。
[0016]本专利技术的编码基因中包括在SEQ ID NO:2基础上由于密码子简并性而产生的序列，遗传密码子的简并性并不影响该序列编码具有β
‑
木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶及β
‑
葡糖苷酶活性的重组蛋白。
[0017]第三方面，本专利技术提供一种表达载体，其包含本专利技术所述的核酸。
[0018]本专利技术所述表达载体可为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
[0019]优选地，所述质粒具体可为pPICZαA。
[0020]第四方面，本专利技术提供一种重组菌，其包含本专利技术所述的表达载体。
[0021]本专利技术所述重组菌可以是通过将上述任一表达载体导入酵母、细菌、真菌或藻获得。
[0022]优选地，所述酵母可以是巴斯德毕赤酵母X
‑
33(Pichia pastoris X
‑
33)。
[0023]第五方面，本专利技术提供所述重组蛋白、表达载体或重组菌在木质纤维素转化中的应用。
[0024]第六方面，本专利技术提供一种进行木质纤维素转化的方法，所述方法使用本公开的重组蛋白、表达载体或重组菌。
[0025]在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：将含有所述重组蛋白的稀释液与含木质纤维素的底物溶液混合，在45
‑
55℃反应2.5
‑
3.5h，离心，沸水浴3
‑
5min终止反应。
[0026]在一些实施方案中，木质纤维素包括，但不限于，A2XX、A
2,3
XX、XA3XX、纤维二糖、纤维三糖和纤维四糖。
[0027]在一些实施方案中，底物溶液用pH 4.5的乙酸钠缓冲液配置，底物浓度为0.5
‑
1.5％(w/v)，优选1％(w/v)。
[0028]在一些实施方案中，含有重组蛋白的稀释液与含木质纤维素的底物溶液的混合溶液在50℃反应3h；短暂离心后，沸水浴2min，终止反应；用HPLC检测反应底物。
[0029]第七方面，本专利技术提供引物对，所述引物对能够扩增上述任一编码基因或核酸的全长或其任一片段。
[0030]在一些实施方案中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0031]第八方面，本专利技术提供制备所述重组蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：发酵含
有所述重组蛋白的编码基因的表达盒的微生物，使所述重组蛋白的编码基因表达，得到含有所述重组蛋白的重组菌培养物，纯化所述重组菌培养物，得到所述重组蛋白。
[0032]在一些实施方案中，发酵上述任一重组菌都能够得到所述重组蛋白。
[0033]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其包括对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第109位至第544位的氨基酸序列，或与其具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述重组蛋白包括与对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第109位至第544位的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述重组蛋白包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性序列同一性的氨基酸序列；优选地，所述重组蛋白还包括在位于N端或C端的标签。2.编码权利要求1所述重组蛋白的核酸。3.一种表达载体，其包含权利要求2所述的核酸。4.一种重组菌，其包含权利要求3所述的表达载体。5.权利要求1的重组蛋白、权利要求3的表达载体或权利要求4的重组菌在木质纤维素转化中的应用。6.一种进行木质纤维素转化的方法，所述方法使用权利要求1的重组蛋白、权利要求3的表达载体或权利要求4的重组菌；优选地，所述方法包括如下步骤：将含有所述重组蛋白的稀释液与含木质纤维素的底物液混合，在45
‑
55℃反应2.5
‑
3.5h，离心，沸水浴3
‑
5min终止反应。7.引物对，其扩增权利要求2或3所述核酸的全长或其任一片段。8.一种制备权利要求1所述重组蛋白的方法，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁红莉，刘亮，张瑜，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：