改变底物通道酸碱性的催化活性提高的壳聚糖酶突变体制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及一种改变底物通道酸碱性的催化活性提高的壳聚糖酶突变体。基于底物通道调控的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶BsCsn46A，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的壳聚糖酶的第49位丙氨酸突变为碱性氨基酸赖氨酸，所述突变体为A49K。本发明专利技术的壳聚糖酶突变体与野生型壳聚糖酶相比，该突变体以壳聚糖为底物，催化活性比野生型提高了1.13倍。倍。

【技术实现步骤摘要】
subtilis)来源的壳聚糖酶BsCsn46A，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，底物通道上经过分析，发现潜在的与催化活性相关的突变位点，将通道位点突变成代表性酸性或代表性碱性氨基酸，定向突变筛选出酶催化活性提高的突变体。
[0007]将上述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列第49位进行定点突变，即丙氨酸突变为碱性氨基酸的赖氨酸和酸性氨基酸的天冬氨酸，突变体标记为A49K和A49D。枯草芽孢杆菌壳聚糖酶BsCsn46A氨基酸序列为SEQ ID NO:1，核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述壳聚糖酶突变体A49K氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述壳聚糖酶突变体核苷酸序列为SEQ ID NO:4，所述壳聚糖酶突变体A49D的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述壳聚糖酶突变体核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
[0008]使用DNS法测定酶活，结果显示壳聚糖酶突变体A49K与野生型壳聚糖酶相比，该突变体以壳聚糖为底物，催化活性比野生型提高了1.13倍。
[0009]本专利技术提供了一种定点突变改造的突变重组壳聚糖酶，并在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中表达。所述发生突变的氨基酸位点为将壳聚糖酶(BsCsn46A)第49位丙氨酸突变为赖氨酸(A49K)。
[0010]本专利技术提供携带有上述编码壳聚糖酶突变体的基因的重组载体以及转化/转染重组载体的重组菌。
[0011]本专利技术还提供了上述壳聚糖酶突变体在催化水解壳聚糖产壳寡糖上的应用，具体的，本专利技术的突变体在催化水解壳聚糖过程中，催化活性得到了显著提升。
[0012]本专利技术提供的壳聚糖酶突变体与野生壳聚糖酶相比，将该壳聚糖酶突变体应用于水解产壳寡糖具有广阔的应用前景。
附图说明
[0013]图1为野生型和突变体的酶活，其中，Wild
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type为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A；图2为A49K壳聚糖酶蛋白的结构图。
具体实施方式
[0014]为了进一步提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的壳聚糖酶BsCsn46A的酶活，本专利技术通过对BsCsn46A的底物通道进行分析，发现潜在的与催化活性相关的突变位点，将通道位点突变成酸性或碱性的氨基酸，定向突变筛选出酶催化活性提高的突变体。
[0015]将BsCsn46A氨基酸序列SEQ ID NO:1提交至SWISS
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MODEL构建该酶的三维结构；利用底物通道分析技术对获得的壳聚糖酶三维结构进行分析获得可以影响酶催化活性的氨基酸位点，确定位于底物通道的第49号位点为潜在的影响催化活性的位点；将该位点突变成代表性碱性氨基酸（赖氨酸K）和代表性酸性氨基酸（天冬氨酸D）。
[0016]利用定点突变技术，以野生型壳聚糖酶BsCsn46A基因SEQ ID NO:2作为模板，引物序列如表1所示，进行PCR扩增。
[0017]表1引物序列
[0018]反向PCR体系：
[0019]反向PCR扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性50 s，65℃退火30 s，68℃延伸12.5 min，12个循环；4℃保温。
[0020]将扩增的PCR产物用额外的0.7 μL DpnI消化2小时以去除质粒模板。将冷却的反应混合物取10 μL直接转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，后培养1h离心，重悬涂布，37℃过夜培养转化子，挑取单菌落转到液体LB培养基过夜培养。将获得的携带突变质粒的重组细胞送去上海生物工程有限公司测序，含有正确质粒的突变体通过质粒提取试剂盒提取质粒，转化到大肠杆菌E.coli BL21细胞中，保存甘油菌。
[0021]将保存的含有突变质粒的菌株以千分之一的接种量接到10 mL LB液体培养基，摇床37℃，160rpm过夜培养，取1mL菌液转接到100 mL LB培养基扩大培养3h，加入诱导剂IPTG，摇床16℃，160rpm过夜培养。
[0022]经过诱导表达的突变体在摇床培养后，收集菌体并超声破碎。将上清液通过Ni
‑
IDA亲和色谱法进行纯化。将上清液加载到Ni
‑
IDA柱上，先用上样缓冲液充分洗脱未结合的蛋白，再用洗脱液（50 mM Tris
‑
HCl，0.5 mM NaCl，0.1 M 咪唑，pH 8.0）洗脱蛋白质，收集洗脱的蛋白质样品，于
‑
20℃保存。利用Broadford法测定酶液中的蛋白含量。
[0023]壳聚糖酶BsCsn46A及其突变体的酶活测定：使用DNS法测定酶活，反应体系中加入
1475 μL pH缓冲液、18
ꢀµ
L100 mM的Mn
2+
，500 μL 1%胶体壳聚糖溶液，加入25 μL纯化得到的酶液，55℃水浴5 min,，加入1.5 mL DNS溶液终止反应，再用沸水煮5 min，最后使用蒸馏水定容至25 mL，冷却静置。以加ddH2O代替酶液的作空白对照组调零，测定其在520 nm下的吸光度。在此条件下，每分钟催化生成1 μM还原糖的酶量定义为一个酶活单位(U)。
[0024]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶 BsCsn46A 及其突变体的酶学性质最适pH及pH稳定性：在50℃的温度条件下，在pH=6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2磷酸盐缓冲液中测定野生型壳聚糖酶及壳聚糖酶突变体的酶活，以酶活最高点作为100%，测得最适pH见表1。在4℃的条件下，将壳聚糖酶置于pH 6.2的磷酸盐缓冲液中保存2 h，测定0h、2h的酶活，以0 h时测定的壳聚糖酶酶活作为100%。
[0025]最适温度及温度稳定性：在最适pH条件下，将反应体系分别置于40
‑
75℃下进行反应，测定壳聚糖酶的酶活，以酶活最高点的温度为最适温度。将壳聚糖酶置于55℃的条件下保存2 h，0 h时测定的壳聚糖酶酶活作为100%。
[0026]野生型壳聚糖酶及其突变体的酶学性质如图1及表2所示。突变体A49K催化活性显著高于野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A。
[0027]表2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A及其突变体的酶学性质
[0028]从上述结果可以看出，壳聚糖酶突变体A49K催化活性显著提升，其最适pH为6.2，最适温度为50℃。
[0029]以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，本专利技术的保护范围不限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本专利技术的保护范围内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖酶突变体，其特征在于：所述壳聚糖酶突变体为来源于枯草芽孢杆菌壳聚糖酶BsCsn46A的氨基酸序列的第49位丙氨酸突变为赖氨酸，其他氨基酸残基保持不变；所述来源于枯草芽孢杆菌壳聚糖酶BsCsn46A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述壳聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.一种基因，其特征在于，编码权利要求1所述的壳聚糖酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭静，丁飞，高文君，满在伟，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：