基于P450基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及基于P450基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及其试剂盒。本发明专利技术发现细胞色素P450基因的表达量上升与二斑叶螨对阿维菌素抗性相关，进而针对其非保守片段区为靶目标序列，设计特异性引物，再配合内参基因的特异性引物，建立了一种用于二斑叶螨对阿维菌素抗性检测的实时荧光定量PCR检测方法。即将其作为分子标记辅助实现田间二斑叶螨种群对阿维菌素杀虫剂的早期检测和预警。较之现有生物测定技术而言，本发明专利技术具有特异性更强，灵敏度和准确度更高，可以准确、快速、特异、便捷地检出供试二斑叶螨是否对阿维菌素产生了抗性。斑叶螨是否对阿维菌素产生了抗性。斑叶螨是否对阿维菌素产生了抗性。

【技术实现步骤摘要】
基于P450基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及其试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及基于细胞色素P450基因的过表达对二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法。

技术介绍

[0002]二斑叶螨（Tetranychus urticae）属真螨目、叶螨科、叶螨属，其体色为黄绿色，有时也被称为白蜘蛛，是一种几乎遍布全世界发生并造成为害的重大农业害螨（Grbi
ć et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature, 2011, 479(7374): 487
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492）。其寄主植物广泛，可为害茄子、菜豆、甜瓜、西瓜、草莓等重要经济作物。二斑叶螨除了卵期以外，其他的三个螨态（成螨、幼螨和若螨）均可通过口针刺吸植物的汁液，造成叶片出现失绿发黄的白色小点，螨口数量增大时可在植株茎叶上出现吐丝结网现象，为害严重者植株叶片会变成灰白色至暗褐色，甚至干枯脱落，或导致整株死亡，缩短结果期等，给农作物健康生长带来经济损失（姬秀枝，等. 蔬菜二斑叶螨的危害及防治. 中国果菜，2007，124 (5): 36）。二斑叶螨分布广泛，群集在叶片背面为害，其体型微小，成螨仅有0.5mm，繁殖周期短、世代重叠、可营孤雌生殖，这些生物学特性也加重了该螨种群的快速扩繁。另外，二斑叶螨对化学药剂能快速产生抗药性，目前，二斑叶螨已对超过93种化学杀虫剂产生了不同程度的抗药性，主要包括有机磷类、拟除虫菊酯类、抗生素类（如阿维菌素）以及一些新型的杀螨剂，如联苯肼酯、丁氟螨酯等（Van Leeuwen et al. Acaricide resistance mechanisms in the two
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spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: a review. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40 (8): 563
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572; Xu, et al. Status of pesticide resistance and associated mutations in the two
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spotted spider mite, Tetranychus urticae, in China. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2018, 150: 89
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96）。
[0003]阿维菌素abamectin是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯类化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。阿维菌素作为一种神经毒剂，主要通过触杀和胃毒这两种作用方式杀死靶标生物，其中最主要的作用方式是胃毒活性。害虫、害螨取食阿维菌素后，大量的氯离子通过细胞膜上的通道进入细胞膜内，破坏了细胞膜的正常功能，影响了神经系统动作电位的正常传导，使得靶标生物的神经系统受到损害，导致其逐步死亡。
[0004]二斑叶螨对阿维菌素抗性问题已非常突出，为了更有效的防治二斑叶螨及科学应用阿维菌素，及时明确二斑叶螨种群对阿维菌素的抗性是一个极为重要的基础，目前二斑叶螨对阿维菌素的抗性监测常采用传统的生物测定方法。然而，常用的传统的生物测定方法存在一些明显的缺点：（1）检测周期长：二斑叶螨的生物测定从测试叶片浸药、挑取试虫、结果镜检、死亡试虫判断等一系列过程，需要耗时超过30个小时；（2）试虫需要量大：测定一
Manag. Sci., 2021, 77(3):1204
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1213）。基于此，建立一种叶螨对阿维菌素抗性检测方法对于二斑叶螨的抗性治理具有极其重要的实践意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过研究发现一个P450基因CYP392A11（基因序列如SEQ ID No.1所示）在阿维菌素抗性的二斑叶螨种群中呈现明显的过量表达，其异源表达的蛋白可体外代谢阿维菌素，表明该CYP392A11基因表达量上调与阿维菌素抗性密切相关。基于此，该基因可以作为阿维菌素抗性产生的相关基因，利用实时荧光定量PCR技术检测CYP392A11表达量的上调水平是一种有效检测田间害螨对阿维菌素抗性的可行方法。二斑叶螨早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药性风险预警方面提供技术手段，并在减少害虫为害损失、促进合理选药用药、保障蔬菜、果品等农产品的质量安全和保障人民身体健康等方面具有重要的意义。因此，建立这种准确、简便、快速、可靠的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测手段具有重要的实践意义。
[0007]本专利技术首先提供二斑叶螨细胞色素P450基因在检测或监测二斑叶螨对阿维菌素抗性中的应用。
[0008]具体地，检测基因的表达量上升，表明二斑叶螨对阿维菌素产生了抗药性。
[0009]更具体地，其通过用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的PCR检测试剂盒来进行检测，优选地以二斑叶螨细胞色素P450基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，优选地，所述试剂盒包含以下叶螨靶标基因细胞色素P450基因特异性引物序列：上游引物：5'
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TCCCTGGTGCTGTTGATGAC
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3' （SEQ ID No.2），下游引物：5'
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GCTCGTACCAAGACCGACAT
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3'（SEQ ID No.3）。
[0010]本专利技术因而提供一种用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的PCR检测试剂盒，其包含以下以二斑叶螨细胞色素P450基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，优选地，所述试剂盒包含以下叶螨靶标基因细胞色素P450基因特异性引物序列：上游引物：5'
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TCCCTGGTGCTGTTGATGAC
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3'（SEQ ID No.2），下游引物：5'
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GCTCGTACCAAGACCGACAT
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3'（SEQ ID No.3）。
[0011]进一步，所述试剂盒还含有逆转录酶，脱氧核糖核酸酶DNase，RNA抑制剂RNase，dNTP混合物，基因特异性扩增引物，氯化镁MgCl2溶液，热启动Taq DNA聚合酶，荧光定量反应液，缓冲液Buffer，去RNA酶RNase
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free水。
[0012]更进一步地，还包括阳性对照及阴性对照样品，进一步以Actin基因作为内参基因设计引物。
[0013]本专利技术提供一种检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的PCR检测方法，包括以下步骤：（1）提取待测二斑叶螨群体的RNA样品，并反转录为cDNA模板；（2）将所述cDNA模板加入到含有叶螨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.二斑叶螨细胞色素P450基因在检测或监测二斑叶螨对阿维菌素抗性中的应用，所述二斑叶螨细胞色素P450基因是基因CYP392A11。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，检测基因的表达量上升，表明二斑叶螨对阿维菌素产生了抗药性。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，以二斑叶螨细胞色素P450基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对通过PCR来进行检测。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对包括上游引物：5'
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TCCCTGGTGCTGTTGATGAC
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3'和下游引物：5'
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GCTCGTACCAAGACCGACAT
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3'。5.一种用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于，包含以下以二斑叶螨细胞色素P450基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对：上游引物：5'
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TCCCTGGTGCTGTTGATGAC
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3'，下游引物：5'
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GCTCGTACCAAGACCGACAT
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3'。6.如权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，还含有逆转录酶，脱氧核糖核酸酶DNase，RNA抑制剂RNase，dNTP混合物，基因特异性扩增引物，氯化镁MgCl2溶液，热启动Taq DNA聚合酶，荧光定量反应液，缓冲液Buffer，去RNA酶水。7.如权利要求5所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，进一步地，还包括阳性对照及阴性对照样品。8.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少丽，徐丹丹，廖豪杰，董瑞，张友军，吴青君，谢文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：