密码子优化的REP1基因及其用途制造技术

本公开提供了编码人REP1的密码子优化的核苷酸序列、包含密码子优化的REP1序列的载体和宿主细胞，以及治疗视网膜病症，诸如无脉络膜症的方法，所述方法包括向受试者施用编码人REP1的密码子优化的序列。REP1的密码子优化的序列。REP1的密码子优化的序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】密码子优化的REP1基因及其用途
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2020年9月2日提交的美国临时专利申请序列号63/073,837的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
[0002]经由EFS
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WEB提交序列表在2021年7月28日或其前后创建的题为“090400
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5011
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WO
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Sequence
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Listing”的计算机可读文本文件(文件大小为大约27KB)含有本申请的序列表并特此通过引用全文并入。
[0003]专利技术背景无脉络膜症是一种罕见的、X连锁隐性形式的遗传性视网膜变性，其大约在50,000名男性中影响1名。该疾病引起视力的逐渐丧失，从儿童夜盲症开始，随后是周边视力丧失，并在以后的生活中进展为中心视力的丧失。进展在个体生命的整个过程中持续进行，但是变化速率和视力丧失程度在受影响的人中可变，即使在同一家族中也如此。
[0004]无脉络膜症由编码Rab护航蛋白
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1(REP1)的CHM基因中的功能缺失突变所引起，所述Rab护航蛋白
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1是一种参与Rab蛋白的脂质修饰的蛋白。虽然尚未完全了解疾病的完整机制，但在视网膜中缺乏功能性蛋白导致细胞死亡和视网膜色素上皮细胞(RPE)、光感受器和脉络膜的逐渐退化。
[0005]尽管目前尚无批准的用于无脉络膜症的治疗，但几项临床前研究支持使用CHM的野生型cDNA来挽救无脉络膜症疾病表型。但是，野生型序列在人光感受器和RPE中的次优表达水平对治疗无脉络膜症的基因疗法方法是一种挑战。
[0006]专利技术概述公开了编码人Rab护航蛋白
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1(REP1)蛋白的密码子优化的核酸分子。在一方面，本公开提供了包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸或包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的核苷酸序列的核酸，并且所述核酸编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的人REP1多肽。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由其组成的核酸。在相关实施方案中，核酸以与野生型CHM核酸序列(例如SEQ ID NO:3)在其他方面相同的细胞中的表达水平相比更高的水平表达。
[0007]在一些方面，如本文中所述的密码子优化的核酸分子具有相对于野生型CHM cDNA(GenBank检索号NM_000390.4；SEQ ID NO:3)的人密码子适应指数提高的人密码子适应指数。在一些实施方案中，密码子优化的核酸分子具有至少大约0.9、至少大约0.92、或至少大约0.94的人密码子适应指数。
[0008]在某些实施方案中，核酸含有与SEQ ID NO:3中的G/C核苷酸百分比相比更高的G/C核苷酸百分比。在另一些实施方案中，核酸含有为至少大约55％、至少大约57.5％、至少大约60％或至少大约61％的G/C核苷酸百分比。在一些方面，核酸含有为大约55％至大约70％、大约57.5％至大约70％或大约61％至大约70％的G/C核苷酸百分比。
[0009]在另一些实施方案中，核酸相对于SEQ ID NO:3包含一个或多个优化的参数：最佳
密码子的频率；直接重复序列的最大长度的减少；限制酶的去除，包括但不限于Bglll(AGATCT)的去除；顺式作用元件的去除，包括但不限于以及去稳定(ATTTA)元件的去除。
[0010]在另一个实施方案中，核酸可操作地连接至至少一个转录控制序列，优选与核酸异源的转录控制序列。在一些方面，转录控制序列是导致核酸例如在感光细胞中的细胞特异性表达的细胞特异性或组织特异性启动子，诸如在RPE中选择性表达的卵黄状黄斑营养不良2启动子。在另一些方面，转录控制序列是在许多细胞类型中导致类似的核酸表达水平的组成型启动子(例如CAG、CBA(鸡β肌动蛋白)、CMV或PGK启动子)。在优选实施方案中，转录控制序列包含CAG启动子，该CAG启动子包含(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β
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肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子以及(iii)Miyazaki等人,Gene79(2):269
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77(1989)中描述的兔β
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珠蛋白基因的剪接受体。在一个特别优选的实施方案中，CAG启动子包含SEQ ID NO:4的序列或包含与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列：ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.编码SEQ ID NO:2的人Rab护航蛋白
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1(REP1)蛋白并经过密码子优化用于在人中表达的核酸，所述核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或包含与其具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中与SEQ ID NO:3的野生型REP1核苷酸序列在其他方面相同的细胞中的表达水平相比，所述核酸以更高的水平表达。2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述核苷酸序列具有至少0.94的密码子适应指数。3.根据权利要求1所述的核酸，其包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。4.表达盒，其包含根据权利要求1至3任一项所述的核酸和可操作地连接至所述核酸序列并与所述核酸序列异源的表达控制序列。5.权利要求4所述的表达盒，其中所述表达控制序列是组成型启动子，优选包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、或至少98％同一性的序列的CAG启动子。6.权利要求5所述的表达盒，其从5'至3'包含：(a)AAV2末端重复，(b)CAG启动子，(c)SEQ ID NO:1的密码子优化的REP1基因，(d)SV40多聚腺苷酸化序列，和(e)AAV2末端重复。7.权利要求6所述的表达盒，其中所述5'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列和/或其中所述CAG启动子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或其中所述SV40多聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列和/或其中所述3'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。8.权利要求7所述的表达盒，其包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的序列，或由其组成。9.权利要求3所述的表达盒，其中所述表达控制序列是指导所述核酸在视杆(rods)和视锥(cones)中的优先表达的启动子。10.载体，其包含根据权利要求1至3任一项所述的核酸或根据权利要求4至9任一项所述的表达盒。11.权利要求10所述的载体，其中所述载体是重组腺相关(rAAV)载体。12.权利要求11所述的载体，其中所述rAAV载体包含血清型2、4、5或8的AAV衣壳或其变体。13.权利要求12所述的载体，其中所述rAAV载体包含AAV2衣壳或其变体。14.权利要求13所述的载体，其中所述rAAV载体包含含有衣壳蛋白的AAV2衣壳变体，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9的序列或由其组成。15.权利要求11
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14任一项所述的载体，其中所述rAAV载体包含核酸，所述核酸从5'至3'包含：(a)AAV2末端重复，(b)CAG启动子，(c)SEQ ID NO:1的密码子优化的REP1基因，(d)SV40多聚腺苷酸化序列，和(e)AAV2末端重复。16.权利要求15所述的载体，其中所述5'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列和/或其中所述CAG启动子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或其中所述SV40多聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列和/或其中所述3'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。17.权利要求16所述的载体，其中所述rAAV包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、或至少98％同一性的序列。18.权利要求17所述的载体，其中所述rAAV包含(i)含有衣壳蛋白的衣壳，所述衣壳蛋
白包含SEQ ID NO:9的序列或由其组成，和(ii)包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或由其组成的核酸。19.宿主细胞，其包含根据权利要求1至3任一项所述的核酸或根据权利要求4至9任一项所述的表达盒。20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。21.权利要求19或20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、BHK21细胞或Vero细胞和/或其中所述宿主细胞在悬浮培养或细胞培养室培养中生长和/或其中所述宿主细胞是感光细胞、视网膜神经节细胞、胶质细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。22.在有需要的受试者中治疗无脉络膜症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1
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3任一项所述的核酸、根据权利要求4
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9任一项所述的表达盒或根据权利要求10
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18任一项所述的载体。23.在有需要的受试者中治疗无脉络膜症的方法，其包括向所述受试者施用传染性rAAV，所述传染性rAAV包含(i)AAV衣壳和(ii)核酸，所述核酸从5'至3'包含：(a)AAV2末端重复，(b)CAG启动子，(c)SEQ ID NO:1的密码子优化的REP1基因，(d)SV40多聚腺苷酸化序列，和(e)AAV2末端重复。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述5'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列和/或其中所述CAG启动子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或其中所述SV40多聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列和/或其中所述3'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述rAAV包含(i)含有衣壳蛋白的衣壳，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9的序列或由其组成，和(ii)包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或由其组成的核酸。26.根据权利要求22
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25任一项所述的方法，其中所述核酸或载体通过玻璃体内或视网膜下注射施用于所述受试者和/或其中所述载体以大约10
10
个载体基因组(vg)/眼至大约10
13
vg/眼，优选大约1
×
10
11
vg/眼至大约5
×
10
12
vg/眼的剂量，更...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：四D分子治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：