【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】developmental stage
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specific repressor BCL11A.”Science 322:1839(2008))。由于增加的γ
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珠蛋白降低了分别由β
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珠蛋白的突变或降低的表达引起的β
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血红蛋白病、镰状细胞病和β
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地中海贫血的临床严重程度，因此对BCL11A进行基因编辑以使γ
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珠蛋白的表达增加超过剩余的约1％胎儿型血红蛋白已被提议作为患有血红蛋白病的成人中一种有吸引力的治疗策略(Smith,E.C.等人，“Strict in vivo specificity of the Bcl11a erythroid enhancer.”Blood128(19):2338(2016))。
[0008]CRISPR/Cas系统的出现以及这些最小系统的可编程性质有助于它们作为基因组操作和工程改造的通用技术的用途。迄今为止，使用CRISPR/Cas系统治疗血红蛋白病仅限于对离体细胞进行编辑，随后移植到患有潜在血红蛋白病的受试者中。因此，需要调控BCL11A的组合物和方法，以减少患有这些疾病的受试者体内的直接γ
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珠蛋白基因启动子抑制。本文提供了用于靶向BCL11A基因以满足这种需要的组合物和方法。
技术实现思路
[0009]本公开涉及用于改变细胞中包含BCL11A基因的靶核酸的经修饰的2类V型CRISPR蛋白和向导核酸的组合物。2类V型CRISPR蛋白和向导核酸经修饰以便被动进入靶细胞。2类
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含2类V型CRISPR蛋白和第一向导核糖核酸(gRNA)的系统，其中所述gRNA包含与包含聚嘧啶束结合蛋白1(BCL11A)基因的靶核酸序列互补的靶向序列。2.根据权利要求1所述的系统，其中所述gRNA包含与靶核酸序列互补的靶向序列，所述靶核酸序列选自：a.BCL11A内含子；b.BCL11A外显子；c.BCL11A内含子
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外显子连接；d.BCL11A调控元件；和e.基因间区域。3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，其中所述BCL11A基因包含野生型序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述gRNA是单分子gRNA(sgRNA)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的系统，其中所述gRNA是双分子gRNA(dgRNA)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含选自SEQ ID NO:272
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2100和2286
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26789的序列，或与其具有至少约65％、至少约75％、至少约85％或至少约95％同一性的序列。7.根据权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含选自SEQ ID NO:272
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2100和2286
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26789的序列。8.根据权利要求7所述的系统，其中所述靶向序列具有从所述序列的3'末端去除的单个核苷酸。9.根据权利要求7所述的系统，其中所述靶向序列具有从所述序列的所述3'末端去除的两个核苷酸。10.根据权利要求7所述的系统，其中所述靶向序列具有从所述序列的所述3'末端去除的三个核苷酸。11.根据权利要求7所述的系统，其中所述靶向序列具有从所述序列的所述3'末端去除的四个核苷酸。12.根据权利要求7所述的系统，其中所述靶向序列具有从所述序列的所述3'末端去除的五个核苷酸。13.根据权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与BCL11A外显子的序列互补。14.根据权利要求13所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与选自BCL11A外显子1序列、BCL11A外显子2序列、BCL11A外显子3序列、BCL11A外显子4序列、BCL11A外显子5序列、BCL11A外显子6序列、BCL11A外显子7序列、BCL11A外显子8序列和BCL11A外显子9序列的序列互补。15.根据权利要求14所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与选自BCL11A外显子1序列、BCL11A外显子2序列和BCL11A外显子3序列的序列互补。16.根据权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与BCL11A调控元件的序列互补。17.根据权利要求16所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与所述BCL11A基因的启动子的序列互补。
18.根据权利要求16所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与增强子调控元件的序列互补。19.根据权利要求18所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与包含所述BCL11A基因的GATA1红细胞特异性增强子结合位点(GATA1)的序列互补。20.根据权利要求16所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列与所述BCL11A基因的所述GATA1结合位点的5'端的序列互补。21.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含UGGAGCCUGUGAUAAAAGCA(SEQ ID NO:22)的序列或与其具有至少90％或95％序列同一性的序列。22.根据权利要求19所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列由UGGAGCCUGUGAUAAAAGCA(SEQ ID NO:22)的序列组成。23.根据权利要求18所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含UGCUUUUAUCACAGGCUCCA(SEQ ID NO:23)的序列或与其具有至少90％或95％序列同一性的序列。24.根据权利要求18所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列由UGCUUUUAUCACAGGCUCCA(SEQ ID NO:23)的序列组成。25.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含CAGGCUCCAGGAAGGGUUUG(SEQ ID NO:2949)的序列或与其具有至少90％或95％序列同一性的序列。26.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列由CAGGCUCCAGGAAGGGUUUG(SEQ ID NO:2949)的序列组成。27.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含GAGGCCAAACCCUUCCUGGA(SEQ ID NO:2948)的序列或与其具有至少90％或95％序列同一性的序列。28.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列由CAGGCUCCAGGAAGGGUUUG(SEQ ID NO:2948)的序列组成。29.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含AGUGCAAGCUAACAGUUGCU(SEQ ID NO:15747)的序列或与其具有至少90％或95％序列同一性的序列。30.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列由AGUGCAAGCUAACAGUUGCU(SEQ ID NO:15747)的序列组成。31.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含AUACAACUUUGAAGCUAGUC(SEQ ID NO:15748)的序列或与其具有至少90％或95％序列同一性的序列。32.根据权利要求19或权利要求20所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列由AUACAACUUUGAAGCUAGUC(SEQ ID NO:15748)的序列组成。33.根据权利要求1至32中任一项所述的系统，所述系统还包含第二gRNA，其中与所述第一gRNA的所述gRNA的所述靶向序列相比，所述第二gRNA具有与所述BCL11A靶核酸的不同或重叠部分互补的靶向序列。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述第二gRNA的所述靶向序列与所述GATA1结合位点序列的5'或3'的所述靶核酸的序列互补。35.根据权利要求33所述的系统，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA各自具有与所述BCL11A基因的所述启动子内的序列互补的靶向序列。36.根据权利要求1至35中任一项所述的系统，其中所述第一gRNA或所述第二gRNA具有支架，所述支架包含选自SEQ ID NO:2238
‑
2285、26794
‑
26839和27219
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27265的序列，或与其具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列同一性的序列。37.根据权利要求1至36中任一项所述的系统，其中所述第一gRNA或所述第二gRNA具有包含选自SEQ ID NO:2238
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2285、26794
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26839和27219
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27265的序列的支架。38.根据权利要求1至36中任一项所述的系统，其中所述第一gRNA或所述第二gRNA具有由选自SEQ ID NO:2238
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2285、26794
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26839和27219
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27265的序列组成的支架。39.根据权利要求38所述的系统，其中所述第一gRNA或所述第二gRNA具有由SEQ ID NO:2238或SEQ ID NO:26800的所述序列组成的支架。40.根据权利要求36至39中任一项所述的系统，其中靶向序列与所述gRNA的所述支架的3'末端连接。41.根据权利要求1至40中任一项所述的系统，其中所述2类V型CRISPR蛋白是CasX变体蛋白，所述CasX变体蛋白包含选自SEQ ID NO:59、72
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99、101
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148和26908
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27154的序列，或与其具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的序列。42.根据权利要求41所述的系统，其中所述2类V型CRISPR蛋白是CasX变体蛋白，所述CasX变体蛋白包含选自SEQ ID NO:59、72
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99、101
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148和26908
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27154的序列。43.根据权利要求41所述的系统，其中所述CasX变体蛋白由选自SEQ ID NO:59、72
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99、101
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148和26908
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27154的序列组成。44.根据权利要求42所述的系统，其中所述CasX变体蛋白由选自SEQ ID NO:126、27043、27046、27050的序列组成。45.根据权利要求41所述的系统，其中所述CasX变体蛋白相对于具有选自SEQ ID NO:1
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3的序列的参考CasX蛋白包含至少一个修饰。46.根据权利要求45所述的系统，其中相对于所述参考CasX蛋白，所述至少一个修饰在所述CasX变体蛋白的结构域中包含至少一个氨基酸取代、缺失或取代。47.根据权利要求46所述的系统，其中所述结构域选自非靶链结合(NTSB)结构域、靶链加载(TSL)结构域、螺旋I结构域、螺旋II结构域、寡核苷酸结合结构域(OBD)和RuvC DNA切割结构域。48.根据权利要求41至47中任一项所述的系统，其中所述CasX变体蛋白不包含HNH结构域。49.根据权利要求41至48中任一项所述的系统，其中所述CasX变体蛋白还包含一个或多个核定位信号(NLS)。50.根据权利要求49所述的系统，其中所述一个或多个NLS选自由以下组成的序列：
PKKKRKV(SEQ ID NO:168)、KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:169)、PAAKRVKLD(SEQ ID NO:170)、RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:171)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:172)、RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:173)、VSRKRPRP(SEQ ID NO:174)、PPKKARED(SEQ ID NO:175)、PQPKKKPL(SEQ ID NO:176)、SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:177)、DRLRR(SEQ ID NO:178)、PKQKKRK(SEQ ID NO:179)、RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:180)、REKKKFLKRR(SEQ ID NO:181)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:182)、RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:183)、PRPRKIPR(SEQ ID NO:184)、PPRKKRTVV(SEQ ID NO:185)、NLSKKKKRKREK(SEQ ID NO:186)、RRPSRPFRKP(SEQ ID NO:187)、KRPRSPSS(SEQ ID NO:188)、KRGINDRNFWRGENERKTR(SEQ ID NO:189)、PRPPKMARYDN(SEQ ID NO:190)、KRSFSKAF(SEQ ID NO:191)、KLKIKRPVK(SEQ ID NO:192)、PKKKRKVPPPPAAKRVKLD(SEQ ID NO:193)、PKTRRRPRRSQRKRPPT(SEQ ID NO:26792)、SRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN(SEQ ID NO:194)、KTRRRPRRSQRKRPPT(SEQ ID NO:195)、RRKKRRPRRKKRR(SEQ ID NO:196)、PKKKSRKPKKKSRK(SEQ ID NO:197)、HKKKHPDASVNFSEFSK(SEQ ID NO:198)、QRPGPYDRPQRPGPYDRP(SEQ ID NO:199)、LSPSLSPLLSPSLSPL(SEQ ID NO:200)、RGKGGKGLGKGGAKRHRK(SEQ ID NO:201)、PKRGRGRPKRGRGR(SEQ ID NO:202)、PKKKRKVPPPPAAKRVKLD(SEQ ID NO:203)、PKKKRKVPPPPKKKRKV(SEQ ID NO:204)、PAKRARRGYKC(SEQ ID NO:27199)、KLGPRKATGRW(SEQ ID NO:27200)、PRRKREE(SEQ ID NO:27201)、PYRGRKE(SEQ ID NO:27202)、PLRKRPRR(SEQ ID NO:27203)、PLRKRPRRGSPLRKRPRR(SEQ ID NO:27204)、PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKV(SEQ ID NO:27205)、PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVGIHGVPAA(SEQ ID NO:27206)、PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVAEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:207)、PAAKRVKLDGGKRTADGSEFESPKKKRKVPG(SEQ ID NO:27208)、KRKGSPERGERKRHW(SEQ ID NO:27209)、KRTADSQHSTPPKTKRKVEFEPKKKRKV(SEQ ID NO:27210)、和PKKKRKVGGSKRTADSQHSTPPKTKRKVEFEPKKKRKV(SEQ ID NO:27211)，其中所述一个或多个NLS连接到所述CRISPR蛋白或具有接头肽的相邻NLS，其中所述接头肽选自RS、(G)n(SEQ ID NO:27212)、(GS)n(SEQ ID NO:27213)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:214)、(GGSGGS)n(SEQ ID NO:215)、(GGGS)n(SEQ ID NO:216)、GGSG(SEQ ID NO:217)、GGSGG(SEQ ID NO:218)、GSGSG(SEQ ID NO:219)、GSGGG(SEQ ID NO:220)、GGGSG(SEQ ID NO:221)、GSSSG(SEQ ID NO:222)、GPGP(SEQ ID NO:223)、GGP、PPP、PPAPPA(SEQ ID NO:224)、PPPG(SEQ ID NO:27214)、PPPGPPP(SEQ ID NO:225)、PPP(GGGS)n(SEQ ID NO:27215)、(GGGS)nPPP(SEQ ID NO:27216)、AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:27217)和TPPKTKRKVEFE(SEQ ID NO:27218)，其中n为1至5。51.根据权利要求49或权利要求50所述的系统，其中所述一个或多个NLS在所述CasX变体蛋白的C末端处或其附近。52.根据权利要求49或权利要求50所述的系统，其中所述一个或多个NLS在所述CasX变体蛋白的N末端处或其附近。53.根据权利要求49或权利要求50所述的系统，所述系统包含在所述CasX变体蛋白的所述N末端处或其附近以及在所述C末端处或其附近的一个或多个NLS。54.根据权利要求41至53中任一项所述的系统，其中所述CasX变体能够与向导核酸(gRNA)形成核糖核蛋白复合物(RNP)。
55.根据权利要求54所述的系统，其中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的参考CasX蛋白和包含SEQ ID NO:4
‑
16中任一项的序列的gRNA的RNP相比，所述CasX变体蛋白和所述gRNA变体的RNP表现出至少一种或多种改善的特征。56.根据权利要求55所述的系统，其中所述改善的特征选自由以下组成的组中的一者或多者：所述CasX变体的改善的折叠；改善的对向导核酸(gRNA)的结合亲和力；改善的对靶DNA的结合亲和力；在所述靶DNA的编辑中利用更广谱的包括ATC、CTC、GTC或TTC的一种或多种原间隔序列临近基序(PAM)序列的改善能力；改善的所述靶DNA的解旋；增加的编辑活性；改善的编辑效率；改善的编辑特异性；增加的核酸酶活性；提高的靶核酸序列切割速率；增加的用于双链切割的靶链加载；减少的用于单链切口的靶链加载；减少的脱靶切割；改善的非靶DNA链的结合；改善的蛋白质稳定性；改善的蛋白质溶解度；改善的核糖核蛋白复合物(RNP)的形成；更高百分比的有切割能力的RNP；改善的蛋白质:gRNA复合物(RNP)稳定性；改善的蛋白质:gRNA复合物溶解度；改善的蛋白质产量；改善的蛋白质表达；和改善的融合特征。57.根据权利要求55或权利要求56所述的系统，其中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的所述参考CasX蛋白和包含SEQ ID NO:4
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16中任一项的序列的所述gRNA的所述RNP相比，所述CasX变体蛋白和所述gRNA变体的所述RNP的所述改善特征改善了至少约1.1倍至约100倍或更多倍。58.根据权利要求55或权利要求56所述的系统，其中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的所述参考CasX蛋白和包含SEQ ID NO:4
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16中任一项的序列的所述gRNA相比，所述CasX变体蛋白的所述改善特征改善了至少约1.1倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约100倍或更多倍。59.根据权利要求55或权利要求56所述的系统，其中与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的所述参考CasX蛋白和包含SEQ ID NO:4
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16中任一项的序列的所述gNA相比，所述CasX变体蛋白的所述改善特征改善了至少约1.1倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约100倍或更多倍。60.根据权利要求55至59中任一项所述的系统，其中所述改善的特征包括编辑效率，并且与SEQ ID NO:2的所述参考CasX蛋白和SEQ ID NO:4
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16中任一项的所述gRNA的所述RNP相比，所述CasX变体蛋白和所述gRNA变体的所述RNP包括1.1倍至100倍的编辑效率改善。61.根据权利要求54至59中任一项所述的系统，其中当所述PAM序列TTC、ATC、GTC或CTC中的任一者位于与细胞测定系统中所述gRNA的所述靶向序列具有同一性的原间隔序列的所述非靶链的5
’
端1个核苷酸处时，与在可比较的测定系统中对包含参考CasX蛋白和参考gRNA的RNP的所述编辑效率和/或结合相比，包含所述CasX变体和所述gRNA变体的所述RNP表现出对靶核酸序列更高的编辑效率和/或结合。62.根据权利要求61所述的系统，其中所述PAM序列是TTC。63.根据权利要求62所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含选自SEQ ID NO:17904
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26789的序列。64.根据权利要求61所述的系统，其中所述PAM序列是ATC。65.根据权利要求64所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含选自SEQ ID NO:272
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2100和2286
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5625的序列。
66.根据权利要求61所述的系统，其中所述PAM序列是CTC。67.根据权利要求66所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含选自SEQ ID NO:5626
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13616的序列。68.根据权利要求61所述的系统，其中所述PAM序列是GTC。69.根据权利要求66所述的系统，其中所述gRNA的所述靶向序列包含选自SEQ ID NO:13617
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17903的序列。70.根据权利要求61至68中任一项所述的系统，其中与SEQ ID NO:1
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3的所述参考CasX蛋白中的任一者对所述PAM序列的所述结合亲和力相比，对所述一种或多种PAM序列的所述增加的结合亲和力为至少1.5倍。71.根据权利要求54至70中任一项所述的系统，其中与所述参考CasX蛋白和SEQ ID NO:4
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16的所述gRNA的RNP相比，所述RNP具有至少5％、至少10％、至少15％或至少20％更高百分比的有切割能力的RNP。72.根据权利要求41至71中任一项所述的系统，其中所述CasX变体蛋白包含具有切口酶活性的RuvC DNA切割结构域。73.根据权利要求41至71中任一项所述的系统，其中所述CasX变体蛋白包含具有双链切割活性的RuvC DNA切割结构域。74.根据权利要求1至54中任一项所述的系统，其中所述CasX蛋白是无催化活性的CasX(dCasX)蛋白，并且其中所述dCasX和所述gRNA保留与所述BCL11A靶核酸结合的能力。75.根据权利要求74所述的系统，其中所述dCasX在以下残基处包含突变：a.对应于SEQ ID NO:1的所述CasX蛋白的D672、E769和/或D935；或者b.对应于SEQ ID NO:2的所述CasX蛋白的D659、E756和/或D922。76.根据权利要求75所述的系统，其中所述突变是用丙氨酸取代所述残基。77.根据权利要求1至73中任一项所述的系统，所述系统还包含供体模板核酸。78.根据权利要求77所述的系统，其中所述供体模板包含核酸，所述核酸包含BCL11A基因的至少一部分，所述BCL11A基因的至少一部分选自BCL11A外显子、BCL11A内含子、BCL11A内含子
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外显子连接、BCL11A调控元件和所述GATA1结合位点序列。79.根据权利要求78所述的系统，其中所述供体模板序列包含相对于野生型BCL11A基因的对应部分的一个或多个突变。80.根据权利要求78或权利要求79所述的系统，其中所述供体模板包含核酸，所述核酸包含BCL11A外显子的至少一部分，所述BCL11A外显子的至少一部分选自BCL11A外显子1、BCL11A外显子2、BCL11A外显子3、BCL11A外显子4、BCL11A外显子5、BCL11A外显子6、BCL11A外显子7、BCL11A外显子8和BCL11A外显子9。81.根据权利要求80所述的系统，其中所述供体模板包含核酸，所述核酸包含BCL11A外显子的至少一部分，所述BCL11A外显子的至少一部分选自BCL11A外显子1、BCL11A外显子2和BCL11A外显子3。82.根据权利要求77至81中任一项所述的系统，其中所述供体模板的大小范围为10
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15,000个核苷酸。83.根据权利要求77至82中任一项所述的系统，其中所述供体模板是单链DNA模板或单链RNA模板。
84.根据权利要求77至82中任一项所述的系统，其中所述供体模板是双链DNA模板。85.根据权利要求77至84中任一项所述的系统，其中所述供体模板在所述供体模板的5'和3'末端处或附近包含同源臂，所述同源臂与由所述2类V型CRISPR蛋白引入的所述BCL11A靶核酸中的切割位点侧翼的序列互补。86.一种核酸，所述核酸包含根据权利要求77至85中任一项所述的供体模板。87.一种核酸，所述核酸包含编码根据权利要求41至76中任一项所述的CasX的序列。88.一种核酸，所述核酸包含编码根据权利要求1至40中任一项所述的gRNA的序列。89.根据权利要求87所述的核酸，其中编码所述CasX蛋白的所述序列经密码子优化以用于在真核细胞中表达。90.一种载体，所述载体包含根据权利要求1至40中任一项所述的gRNA、根据权利要求41至76中任一项所述的CasX蛋白或根据权利要求86至89中任一项所述的核酸。91.根据权利要求90所述的载体，其中所述载体还包含一种或多种启动子。92.根据权利要求90或权利要求91所述的载体，其中所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、病毒样颗粒(VLP)、CasX递送颗粒(XDP)、质粒、微环、纳米质粒、DNA载体和RNA载体。93.根据权利要求92所述的载体，其中所述载体是AAV载体。94.根据权利要求93所述的载体，其中所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV
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Rh74或AAVRh10。95.根据权利要求94所述的载体，其中所述AAV载体选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。96.根据权利要求94或权利要求95所述的载体，其中所述AAV载体包含核酸，所述核酸包含以下组分：a.5
’
ITR；b.3
’
ITR；和c.转基因，所述转基因包含与第一启动子可操作地连接的根据权利要求87所述的核酸和与第二启动子可操作地连接的根据权利要求88所述的核酸。97.根据权利要求96所述的载体，其中所述核酸还包含编码所述CasX蛋白的所述序列的3
’
端的聚(A)序列。98.根据权利要求96或权利要求97所述的载体，其中所述核酸还包含一种或多种增强子元件。99.根据权利要求96至98中任一项所述的载体，其中单个AAV颗粒能够含有所述核酸，其中所述AAV颗粒具有转导和有效修饰靶细胞中的靶核酸所必需的所有组分。100.根据权利要求92所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。101.根据权利要求92所述的载体，其中所述载体是包含gag多蛋白的一种或多种组分的XDP。102.根据权利要求101所述的载体，其中所述gag多蛋白的所述一种或多种组分选自基质蛋白(MA)、核衣壳蛋白(NC)、衣壳蛋白(CA)、p1肽、p6肽、P2A肽、P2B肽、P10肽、p12肽、PP21/24肽、P12/P3/P8肽和P20肽。103.根据权利要求101或权利要求102所述的载体，其中所述XDP包含所述gag多蛋白、所述CasX变体蛋白和所述gRNA的所述一种或多种组分。
104.根据权利要求103所述的载体，其中所述CasX变体蛋白和所述gRNA在RNP中缔合在一起。105.根据权利要求101至104中任一项所述的载体，所述载体还包含所述供体模板。106.根据权利要求101至104中任一项所述的载体，所述载体还包含假型病毒包膜糖蛋白或抗体片段，所述假型病毒包膜糖蛋白或抗体片段提供了所述XDP与靶细胞的结合和融合。107.根据权利要求106所述的载体，其中所述靶细胞选自造血干细胞(HSC)、造血祖细胞(HPC)、CD34+细胞、间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞(iPSC)、普通髓系祖细胞、原成红细胞和成红细胞。108.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求90至107中任一项所述的载体。109.根据权利要求108所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自幼仓鼠肾成纤维细胞(BHK)、人胚肾293(HEK293)细胞、人胚肾293T(HEK293T)细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、杂交瘤细胞、NIH3T3细胞、源于SV40遗传物质(COS)的CV
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1(猿猴)细胞、HeLa、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和酵母细胞。110.一种修饰细胞群体中的BCL11A靶核酸序列的方法，所述方法包括向所述群体的细胞中引入：a.根据权利要求1至85中任一项所述的系统；b.根据权利要求86至89中任一项所述的核酸；c.根据权利要求90至100中任一项所述的载体；d.根据权利要求101至107中任一项所述的XDP；或e.(a)至(d)中的两者或更多者的组合，其中所述第一gRNA所靶向的所述细胞的所述BCL11A基因靶核酸序列由所述CasX变体蛋白修饰。111.根据权利要求110所述的方法，其中所述修饰包括在所述群体的所述细胞的所述BCL11A基因靶核酸序列中引入单链断裂。112.根据权利要求110所述的方法，其中所述修饰包括在所述群体的所述细胞的所述BCL11A基因靶核酸序列中引入双链断裂。113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，所述方法还包括将第二gRNA或编码所述第二gRNA的核酸引入所述群体的所述细胞中，其中所述第二gRNA具有与所述第一gRNA相比与所述BCL11A基因靶核酸的不同或重叠部分互补的靶向序列，导致所述群体的所述细胞的所述BCL11A靶核酸的额外断裂。114.根据权利要求110至113中任一项所述的方法，其中所述修饰包括在所述群体的所述细胞的所述BCL11A基因中引入一个或多个核苷酸的插入、缺失、取代、复制或倒...
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