腺相关病毒变体衣壳和其使用方法技术

本发明专利技术涉及腺相关病毒变体衣壳和其使用方法。本文提供了变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其具有相对于亲代AAV衣壳蛋白的氨基酸序列的一种或多种修饰，当存在于AAV病毒粒子中时，所述变体AAV衣壳蛋白赋予一种或多种类型的视网膜细胞与包括未修饰的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对所述视网膜细胞的感染性相比增加的感染性。还提供了重组AAV病毒粒子和其包括如本文所描述的变体AAV衣壳蛋白的药物组合物、制造这些rAAV衣壳蛋白和病毒粒子的方法、以及在研究和临床实践中，例如在例如将核酸序列递送到视网膜的一个或多个细胞以治疗视网膜病症和疾病中使用这些rAAV衣壳蛋白和病毒粒子的方法。病毒粒子的方法。病毒粒子的方法。

【技术实现步骤摘要】
腺相关病毒变体衣壳和其使用方法
[0001]本申请为分案申请，原申请的申请日为2017年5月21日，申请号为201780029293.8(PCT/US2017/032542)，专利技术名称为“腺相关病毒变体衣壳和其使用方法”。
[0002]根据35U.S.C.
§
119(e)，本申请要求于2016年5月13日提交的美国临时专利申请序列号62/336,441的申请日的优先权；于2016年8月22日提交的美国临时专利申请序列号62/378,106的申请日的优先权；于2016年9月7日提交的美国临时专利申请序列号62/384,590的申请日的优先权；于2017年2月3日提交的美国临时专利申请序列号62/454,612的申请日的优先权；其全部公开内容通过引用并入本文。
[0003]通过引用作为文本文件提供的序列表并入
[0004]序列表在本文中作为于2017年5月12日创建并且大小为198KB的文本文件“4D_ST25.txt”提供。文本文件的内容通过引用以其全文并入本文。


[0005]本文公开的专利技术总体上涉及包括变体衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)病毒粒子领域和使用定向进化技术产生这种变体衣壳。

技术介绍

[0006]遗传性视网膜疾病涵盖大量异质性遗传疾病，其影响约3000人中的1人(全世界超过2百万人)，并且是严重视力丧失或失明的主要来源。复杂的多因素视网膜疾病如湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)和糖尿病性视网膜病变(DR)影响甚至更多的个体，目前有170万美国人患有与wAMD相关的严重中央视力丧失，并且患有糖尿病的年龄超过40岁的近三分之一成年人具有视力障碍。这些疾病通常与一种或多种类型的视网膜细胞的功能障碍或死亡相关联，在某些情况下由于缺乏关键蛋白的表达或功能，例如LCA2中的RPE65，在其它情况下由于产生毒性基因产物的基因突变，例如影响视紫红质蛋白折叠的显性突变，或者在又其它情况下由于由蛋白质的异位表达诱导的视网膜生理学变化，例如wAMD中的VEGF。
[0007]解决这种巨大的非医学需求的一种方法是基于基因的腺相关病毒(AAV)介导疗法，其中使用重组腺相关病毒(rAAV)将基因递送到视网膜中的一种或多种类型的细胞以例如替换缺失的基因、纠正显性缺陷基因、或提供连续蛋白质疗法的模板。虽然基于AAV的临床基因疗法已经越来越成功，但是在病毒载体性质方面仍然存在缺点，包含例如以高效率靶向期望的视网膜细胞。例如，已经识别并表征了多种同源灵长类动物AAV血清型和许多非人灵长类血清型，其中AAV2在AAV血清型中是最佳表征的并且是第一种适合作为眼中的基因递送媒剂的。然而，尚未报道这些AAV(包含AAV2)在通过玻璃体内施用递送时有效转导视网膜的较深细胞类型。因此，本领域需要具有优异转导能力的新AAV变体，其将为视网膜细胞提供更有效的基于基因的递送以治疗眼病。本领域需要这种AAV变体，所述AAV变体显示出增强的视网膜转导谱
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与本领域已知的野生型AAV和AAV变体相比，在某些情况下，所述AAV变体广泛地用于某些视网膜细胞类型，在其它情况下，所述AAV变体优先用于某些视网膜细胞类型。
[0008]天然存在的AAV是单链DNA病毒，其含有三个开放阅读框，rep、cap和aap。第一个基因rep对基因组复制必需的四种蛋白质(Rep78、Rep68、Rep52和是Rep40)进行编码，第二个基因cap表达组装形成病毒衣壳的三种结构蛋白(VP1
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3)，并且第三个基因表达对衣壳组装至关重要的组装激活蛋白(AAP)。AAV依赖于辅助病毒的存在进行活性复制，如腺病毒或疱疹病毒。在没有辅助病毒的情况下，AAV建立潜伏状态，其中其基因组以游离方式维持或整合到AAVS1基因座中的宿主染色体中。
[0009]体外和体内定向进化技术可以用于选择AAV变体，所述AAV变体提供对当前基于AAV的基因递送载体的改进。这种定向进化技术是本领域已知的并且描述于例如PCT公开WO 2014/194132和Kotterman&Schaffer(《遗传性自然评论(Nature Review Genetics)》，AOP，2014年5月20日在线出版；doi:10.1038/nrg3742)中，这两者均通过引用以其全部并入本文。定向进化是一种衣壳工程方法，其通过迭代轮次的遗传多样化和选择过程模拟自然进化，从而能够积累逐步改善生物分子的功能如基于AAV的病毒粒子的有益的突变。在此方法中，使野生型AAV cap基因多样化以产生大的遗传文库，其被包装以产生病毒颗粒文库，并且应用选择性压力以分离具有可以克服基因递送障碍的优良表型的独特变体。
[0010]以下中已经公开了AAV变体：例如美国专利号9,193,956；9；186；419；8,632,764；8,663,624；8,927,514；8,628,966；8,263,396；8,734,809；8,889,641；8,632,764；8,691,948；8,299,295；8,802,440；8,445,267；8,906,307；8,574,583；8,067,015；7,588,772；7,867,484；8,163,543；8,283,151；8,999,678；7,892,809；7,906,111；7,259,151；7,629,322；7,220,577；8,802,080；7,198,951；8,318,480；8,962,332；7,790,449；7,282,199；8,906,675；8,524,446；7,712,893；6,491,907；8,637,255；7,186,522；7,105,345；6,759,237；6,984,517；6,962,815；7,749,492；7,259,151；和6,156,303；美国公开号2013/0295614；2015/0065562；2014/0364338；2013/0323226；2014/0359799；2013/0059732；2014/0037585；2014/0056854；2013/0296409；2014/03350542013/0195801；2012/0070899；2011/0275529；2011/0171262；2009/0215879；2010/0297177；2010/0203083；2009/0317417；2009/0202490；2012/0220492；2006/0292117；和2004/0002159；欧洲公开号2692731A1；2383346B1；2359865B1；2359866B1；2359867B1；和2357010B1；1791858B1；1668143B1；1660678B1；1664314B1；1496944B1；1456383B1；2341068B1；2338900B1；1456419B1；1310571B1；1456383B1；1633772B1；和1135468B1；以及国际(PCT)公开号本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变体AAV衣壳蛋白包括在衣壳蛋白的GH
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环中共价插入的长度为7、8、9、10或11个氨基酸的异源肽，其中所述插入肽包含氨基酸序列NKTTNKD（SEQ ID NO:20）。2.根据权利要求1所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述插入肽在氨基酸序列NKTTNKD (SEQ ID NO:20)的氨基和/或羧基末端具有1至3个间隔氨基酸(Y1‑
Y3)。3.根据权利要求2所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述插入肽为LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35)。4.根据权利要求1所述的变体AAV衣壳蛋白，其中插入位置位于对应于AAV2 (SEQ ID NO:2)的VP1的氨基酸570和611的氨基酸之间，或另一种AAV血清型的衣壳蛋白的相应位置。5.根据权利要求4所述的变体AAV衣壳蛋白，其中插入位置位于对应于AAV2 (SEQ ID NO:2)的VP1的氨基酸587和588的氨基酸之间，或另一种AAV血清型的衣壳蛋白的相应位置。6.根据权利要求1所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括相对于AAV2 (SEQ ID NO:2)的VP1的一个或多个氨基酸取代，或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的一个或多个相应的取代。7.根据权利要求6所述的变体AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括相对于AAV2 (SEQ ID NO:2)的VP1的一个或多个以下氨基酸取代：M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、...

【专利技术属性】
技术研发人员：DH柯恩，M科特曼，D谢弗，
申请(专利权)人：四D分子治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：