密码子优化的RPGRORF15基因及其用途制造技术

本公开提供了密码子优化的RPGRorf15序列、包含密码子优化的RPGRorf15序列的载体和宿主细胞，以及治疗视网膜病症，诸如XLRP的方法，所述方法包括向受试者施用密码子优化的RPGRorf15序列。RPGRorf15序列。RPGRorf15序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】密码子优化的RPGRORF15基因及其用途
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2020年9月2日提交的美国临时专利申请序列号63/073,843的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
[0002]经由EFS
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WEB提交序列表在2021年8月11日或其前后创建的题为“090400
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Sequence
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Listing”的计算机可读文本文件(文件大小为大约37KB)含有本申请的序列表，并特此通过引用全文并入本文。
[0003]专利技术背景X连锁视网膜色素变性(XLRP)是一种相对严重且遗传异质性的遗传性视网膜变性。大约70％的XLRP病例是由视网膜色素变性GTP酶调节因子(RPGR)基因中的突变引起的。RPGR基因编码广泛表达的几种不同的可变剪接转录本。编码的蛋白的功能尚不清楚，但研究表明其在称为纤毛的细胞结构中起重要作用。
[0004]一种RPGR同工型含有称为ORF15的独特3'区域，其为567个氨基酸的富含Gly和Glu的羧基末端结构域。含有RPGR基因的外显子1
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13和ORF15区域的这种版本的RPGR蛋白主要在视网膜中的光感受器中表达。RPGR的ORF15区域中的突变占所有XLRP病例的大约60％。
[0005]几项临床前研究支持使用RPGRorf15的野生型cDNA来挽救XLRP疾病表型。但是，野生型序列不佳的序列稳定性对在载体生产过程中维持序列完整性提出了挑战，并且野生型序列在人光感受器中的次优表达水平对治疗XLRP的基因疗法方法是一种挑战。
[0006]专利技术概述公开了编码人视网膜色素变性GTP酶调节因子(RPGR)蛋白的密码子优化的核酸分子。在一方面，本公开提供了包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸或包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的核苷酸序列的核酸，并且所述核酸编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的人RPGR多肽。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或由其组成的核酸。在相关实施方案中，核酸以与野生型RPGR核酸序列(例如SEQ ID NO:3)在其他方面相同的细胞中的表达水平相比更高的水平表达。
[0007]在一些方面，如本文中所述的密码子优化的核酸分子具有相对于野生型RPGR cDNA(GenBank检索号NM_001034853；SEQ ID NO:3)的人密码子适应指数提高的人密码子适应指数。在一些实施方案中，密码子优化的核酸分子具有至少大约0.85、至少大约0.88、或至少大约0.89的人密码子适应指数。
[0008]在某些实施方案中，核酸含有与SEQ ID NO:3中的G/C核苷酸百分比相比更高的G/C核苷酸百分比。在另一些实施方案中，核酸含有为至多大约59％、至多大约58％、或至多大约57％的G/C核苷酸百分比。在一些方面，核酸的平均G/C含量为大约55％至大约59％、大约56％至大约58％。在一些优选实施方案中，平均G/C含量为大约57％。
[0009]在另一些实施方案中，核酸相对于SEQ ID NO:3包含一个或多个优化的参数，其选自负性顺式作用位点(包括但不限于TATA盒和剪接位点)的去除和最佳密码子频率的提高。
[0010]在另一个实施方案中，核酸可操作地连接至至少一个转录控制序列，优选与核酸异源的转录控制序列。在一些方面，转录控制序列是导致核酸例如在感光细胞中的细胞特异性表达的细胞或组织特异性启动子，诸如人视杆光感受器特异性人G蛋白偶联受体视紫红质激酶1(hGRK)或人光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子。在优选实施方案中，转录控制序列包含人视杆光感受器特异性人G蛋白偶联受体视紫红质激酶1(hGRK)启动子。在另一些方面，转录控制序列是组成型启动子，其在许多细胞类型中导致类似的核酸表达水平(例如CAG、CBA、CMV或PGK启动子)。在优选实施方案中，转录控制序列包含如Young等人,Investigative Ophthalmology and Visual Science,44(9):4076
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4085(2003)中所述的人G蛋白偶联受体激酶(hGRK，也称为视紫红质激酶)启动子。在一个特别优选的实施方案中，hGRK启动子包含SEQ ID NO:4的序列或包含与其具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列：GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGG(SEQ ID NO:4)。
[0011]在相关实施方案中，本文中提供了包含可操作地连接至表达控制序列的核酸的表达盒，所述核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列。
[0012]在相关实施方案中，本文中提供了包含核酸的载体，所述核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列。在优选实施方案中，载体是重组腺相关(rAAV)表达载体。在一些实施方案中，rAAV载体包含天然衣壳(例如AAV血清型2或AAV血清型5或AAV血清型8的衣壳)。在另一些实施方案中，rAAV载体包含相对于天然AAV衣壳经修饰(例如包含一个或多个肽插入和/或一个或多个氨基酸取代(例如酪氨酸至苯丙氨酸)和/或氨基酸插入或氨基酸缺失)的衣壳(例如相对于血清型2、5或8的AAV衣壳包含一种或多种修饰)。
[0013]在另一个实施方案中，本文中提供了包含核酸的宿主细胞，所述核酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与其具有至少90％同一性的核苷酸序列。在一些方面，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO细胞、HEK293细胞、HeLa细胞、BHK21细胞、Vero细胞或V27细胞。在相关方面，宿主细胞选自CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、BHK21细胞和Vero细胞。在另一些方面，宿主细胞是感光细胞(例如视杆(rods)；视锥(rods))、视网膜神经节细胞(RGC)、胶质细胞(例如穆勒胶质细胞、小胶质细胞)、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞。在相关实施方案中，本公开提供了提高SEQ ID NO:2的多肽的表达的方法，其包括在核酸分子表达SEQ ID NO:2的多肽的条件下培养宿主细胞，其中相对于包含含有SEQ ID NO:3的核苷酸序列(比较序列)的参考核酸的在相同条件下培养的宿主细胞，多肽的表达提高。
[0014]在另一个实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.编码SEQ ID NO:2的人视网膜色素变性GTP酶调节因子(RPGR)蛋白并经过密码子优化用于在人中表达的核酸，所述核酸包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或包含与其具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核酸与SEQ ID NO:3的野生型RPGR核苷酸序列在其他方面相同的细胞中的表达水平相比以更高的水平表达。2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述核苷酸序列具有至少0.89的密码子适应指数。3.根据权利要求1所述的核酸，其包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。4.表达盒，其包含根据权利要求1至3任一项所述的核酸和可操作地连接至所述核酸序列并与所述核酸序列异源的表达控制序列。5.权利要求4所述的表达盒，其中所述表达控制序列是组成型启动子。6.权利要求4所述的表达盒，其中所述表达控制序列是指导所述核酸在视杆(rods)和视锥(cones)中的优先表达的启动子，优选人G蛋白偶联受体视紫红质激酶1(hGRK)启动子，其包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、或至少98％同一性的序列。7.权利要求6所述的表达盒，其从5'至3'包含：(a)AAV2末端重复，(b)hGRK启动子，(c)SEQ ID NO:1的密码子优化的RPGRorf15基因，(d)SV40多聚腺苷酸化序列，和(e)AAV2末端重复。8.权利要求7所述的表达盒，其中所述5'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列和/或其中所述hGRK启动子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或其中所述SV40多聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列和/或其中所述3'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。9.权利要求8所述的表达盒，其包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％同一性的序列，或由其组成。10.载体，其包含根据权利要求1至3任一项所述的核酸或根据权利要求4至9任一项所述的表达盒。11.权利要求10所述的载体，其中所述载体是重组腺相关(rAAV)载体。12.权利要求11所述的载体，其中所述rAAV载体包含血清型2、5或8的AAV衣壳或其变体。13.权利要求12所述的载体，其中所述rAAV载体包含AAV2衣壳或其变体。14.权利要求13所述的载体，其中所述rAAV载体包含含有衣壳蛋白的AAV2衣壳变体，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9的序列或由其组成。15.权利要求11
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14任一项所述的载体，其中所述rAAV载体包含核酸，所述核酸从5'至3'包含：(a)AAV2末端重复，(b)hGRK启动子，(c)SEQ ID NO:1的密码子优化的RPGRorf15基因，和(d)AAV2末端重复。16.权利要求15所述的载体，其中所述5'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列和/或其中所述hGRK启动子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或其中所述SV40多聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列和/或其中所述3'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。17.权利要求16所述的载体，其中所述rAAV载体包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、或至少98％同一性的序列。
18.权利要求17所述的载体，其中所述rAAV载体包含(i)含有衣壳蛋白的衣壳，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9的序列或由其组成，和(ii)包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或由其组成的核酸。19.宿主细胞，其包含根据权利要求1至3任一项所述的核酸或根据权利要求4至9任一项所述的表达盒。20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。21.权利要求19或20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、BHK21细胞或Vero细胞和/或其中所述宿主细胞在悬浮培养或细胞培养室培养中生长和/或其中所述宿主细胞是感光细胞、视网膜神经节细胞、胶质细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞。22.用于在有需要的受试者中治疗XLRP的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1
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3任一项所述的核酸、根据权利要求4
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9任一项所述的表达盒或根据权利要求10
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18任一项所述的载体。23.用于在有需要的受试者中治疗XLRP的方法，其包括向所述受试者施用传染性rAAV，所述传染性rAAV包含(i)AAV衣壳和(ii)核酸，所述核酸从5'至3'包含：(a)AAV2末端重复，(b)hGRK启动子，(c)SEQ ID NO:1的密码子优化的RPGRorf15基因，(d)SV40多聚腺苷酸化序列，和(e)AAV2末端重复。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述5'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列和/或其中所述hGRK启动子具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列和/或其中所述SV40多聚腺苷酸化序列具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列和/或其中所述3'AAV2末端重复具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述rAAV包含(i)含有衣壳蛋白的衣壳，所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:9的序列或由其组成，和(ii)包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列或由其组成的核酸。26.根据权利要求22
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25任一项所述的方法，其中所述核酸或载体通过眼周、玻璃体内、脉络膜上或视网膜下注射施用于所述受试者和/或其中所述载体以大约10
10
个载体基因组(vg)/眼至大约10
13
vg/眼，优选大约1
×
10
11
vg/眼至大约5
×
10
12
vg/眼的剂量，更优选以大...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：四D分子治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：