靶向乙肝病毒RNA的反义寡核苷酸、对应嵌合分子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向HBV病毒RNA的反义寡核苷酸序列、对应嵌合分子及其应用。本发明专利技术提供了靶向HBV病毒RNA的反义寡核苷酸，基于反义寡核苷酸序列的核糖核酸内切酶水解靶向嵌合分子技术，通过连接臂将核糖核酸酶的激活剂与反义寡核苷酸缀合在一起得到能靶向HBV病毒RNA的反义核酸嵌合药物。根据降低靶标RNA的表达水平的实验结果可见，本发明专利技术提供的反义核酸序列缀合的NATAC嵌合分子能明显降低靶标RNA的表达水平；NATAC嵌合的反义核酸在5～30nM浓度下可显著降解Vero细胞中外源性的HBV病毒的靶标病毒RNA及乙肝表面抗原HBsAg，且在药效上明显优于非嵌合的反义核酸。显优于非嵌合的反义核酸。显优于非嵌合的反义核酸。

【技术实现步骤摘要】
靶向乙肝病毒RNA的反义寡核苷酸、对应嵌合分子及其应用


[0001]本专利技术涉及反义寡核苷酸以及基于反义核酸的核糖核酸内切酶水解靶向嵌合分子技术(Nucleic Acid
‑
hydrolysis TArgeting Chimeras,NATAC)合成的嵌合分子，尤其涉及靶向乙肝病毒的反义寡核苷酸以及用其与核糖核酸酶的激活剂缀合的对应嵌合分子，本专利技术进一步涉及它们在制备预防或治疗乙肝病毒药物中的用途，属于乙肝病毒的基因治疗领域。

技术介绍

[0002]乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，全球约有2.57亿慢性HBV感染者，如不经有效治疗，其中至少有约1/4的人群将最终发展为肝炎，肝硬化甚至肝细胞癌。全年约有88.7万人死于HBV感染所致的肝衰竭，肝硬化和肝细胞癌。
[0003]HBV是一种小包膜嗜肝DNA病毒(Hepadnaviridae)，完整的HBV病毒颗粒也叫Dane颗粒，直径只有42nm，有外壳和核心两个部分。外壳厚7～8nm，是一种由脂质双层和蛋白质组成的囊膜。脂质双层内含有S抗原、前S1和前S2抗原，它们一起构成了外壳上大、中、小三种形式的蛋白，统称为乙肝表面抗原(HbsAg)；核心颗粒直径28nm，呈二十面体立体对称，它的表面才是病毒真正的衣壳，由乙肝病毒的核心抗原(HBcAg)组成。HBV的遗传物质位于Dane颗粒的中心部位，为环状并且不完整的DNA双链，两条链长短不一，长链完整，长度恒定，为负链；短链是正链，长度可变，约为长链的50％～80％。HBV基因组编码四个部分重叠的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)：pre
‑
C/C ORF、pol ORF、pre
‑
S/S ORF和X ORF。pre
‑
C/C ORF编码核衣壳蛋白和前核心分泌蛋白，后者随后被加工生产HBe抗原(HBeAg)；pol ORF编码病毒聚合酶，包括逆转录酶、核糖核酸酶H和末端蛋白结构域；pre
‑
S/S ORF编码前S1蛋白、前S2蛋白和表面蛋白；X ORF编码X蛋白。
[0004]目前，临床治疗慢性乙肝的药物主要有干扰素与核苷酸类药物，如α
‑
干扰素、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯、阿德福韦酯及拉米夫定。干扰素类药物是非特异性的治疗药物，对慢性乙肝治疗效果有限，且具有明显的临床副作用及使用的不便利性。核苷酸类药物可以有效抑制HBV复制，减少或延缓HBV感染的并发症发生，但是不能彻底清除病毒，需要长期服药。一旦出现耐药，可能表现为对所有同类核苷酸类的耐药，无其它用药选择。因此，在现有治疗条件下，慢性感染可以通过长期用药控制，但是基本不可治愈，并且由于潜在的耐药，慢性乙肝感染人群仍面临较高疾病进展风险。
[0005]尽管已有较为成熟的乙肝预防性疫苗。但是，由于早期的疫苗普及率低，疫苗注射后失效，特殊条件感染以及乙肝的cccDNA无法根除等原因，全球范围内乙肝病毒的传播并未停止，因此，已感染人群基数庞大，对新的治疗方法的临床需求强烈。
[0006]HBV生命周期中的每一步都可能成为新药开发靶点，现有的核苷酸类抗病毒药物靶向的步骤是pgRNA的反转录，可降低HBV基因组DNA含量，而对HBV病毒RNA没有直接抑制作用。
[0007]当下，以HBV病毒RNA为靶标的核酸药物是乙肝新药研发的热点，这些核酸药物可
大致分为两类，即小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)类药物和反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotides，ASOs)类药物。siRNA是长的双链RNA(dsRNA)由被称为Dicer的内切核糖核酸酶切割产生的长度为19～21nt的核苷酸片段，其作用机制是与Dicer酶、Argonaute蛋白等生物大分子装配形成RNA诱导沉默复合体(RNA
‑
induced silencing complex，RISC)；然后，siRNA展开形成单链siRNA；作为RISC复合物一部分的单链siRNA可以与互补的病毒RNA结合，并诱导其降解。siRNA技术应用的最大障碍是给药不便和药物靶向肝脏递送问题。siRNA在肠道中被快速降解，因而一般采用注射给药。输液反应与静脉注射剂量有关，因此需要在使用前服用抗组胺药物或皮质类固醇；较新的肝靶向制剂可以皮下注射，能减少副作用，增加给药间隔，改善了患者的耐受性。siRNA代谢稳定，不会直接激活人体免疫系统。一些技术被使用来增加对肝脏的靶向性，包括将siRNA与N
‑
乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联以增强肝细胞对药物的摄取。与siRNA不同，ASOs的作用机理是其寡核苷酸片段通过碱基配对与病毒RNA的互补序列结合，形成DNA：RNA或RNA：RNA的杂交双链，随后通过宿主Rnase H依赖性机制降解病毒RNA转录产物，或通过空间位阻效应阻碍翻译进行，从而使蛋白表达沉默。虽然暂时还没有治疗HBV的核酸药物上市，但一些核酸药物，如vir
‑
2218(siRNA类药物)、GSK3228836(反义寡核苷酸类药物)等在临床试验阶段已表现出强大的抑制HBV能力，有望用于临床治疗。
[0008]现有研究表明，如果把小分子与靶标的简单结合，转化为招募内源性核酸酶对靶标进行切割，可以增强药物的效力与选择性，基于此，如果在ASOs上连接一段能招募内源性核酸酶的功能基团，有望提高核酸药物对靶RNA的降解效力。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的之一是提供靶向乙肝病毒RNA的反义寡核苷酸序列；
[0010]本专利技术的目的之二是提供基于该反义寡核苷酸序列与核糖核酸酶的激活剂缀合得到的对应的NATAC嵌合分子；
[0011]本专利技术的目的之三是将所述的反义寡核苷酸序列以及对应的NATAC嵌合分子应用于制备预防或治疗乙肝病毒的基因治疗药物。
[0012]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0013]本专利技术首先提供了靶向乙肝病毒RNA的反义寡核苷酸(5
′→3′
)，选自包含下述(1)
‑
(36)中的所述的反义寡核苷酸中的任何一种，或者根据靶基因序列在下述(1)
‑
(36)中的所述的反义寡核苷酸3
′
或5
′
端增加或顺延1
‑
3个碱基所得到的反义寡核苷酸：
[0014](1)XpXpGpApCpGpApXpApApGpGpGpApG
[0015](2)GpApXpGpXpGpApXpGpXpXpCpXpCpC
[0016](3)GpCpGpGpXpApXpXpGpXpGpApGpGpA
[0017](4)GpXpXpGpGpXpGpApGpXpGpApXpXpG
[0018](5)ApXpApApCpCpApGpGpApCpApApGpX
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向HBV病毒RNA的反义寡核苷酸，其特征在于，选自包含(1)
‑
(36)中的任何一种反义寡核苷酸，或者根据靶基因序列在(1)
‑
(36)中的任何一种反义寡核苷酸3
′
或5
′
端增加或顺延1
‑
3个碱基所得到的反义寡核苷酸序列：(1)XpXpGpApCpGpApXpApApGpGpGpApG(2)GpApXpGpXpGpApXpGpXpXpCpXpCpC(3)GpCpGpGpXpApXpXpGpXpGpApGpGpA(4)GpXpXpGpGpXpGpApGpXpGpApXpXpG(5)ApXpApApCpCpApGpGpApCpApApGpX(6)GpGpApXpApCpApXpApGpApGpGpXpX(7)XpXpGpApGpApXpCpXpXpCpXpGpCpG(8)XpCpCpCpCpApCpCpXpXpApXpGpApG(9)CpCpCpApXpCpXpCpXpXpXpGpXpXpX(10)GpGpApGpCpCpGpApApApApGpGpXpX(11)CpGpGpCpApGpApCpGpGpApGpApApG(12)CpCpGpCpGpXpApApApGpApGpApGpG(13)CpGpGpCpApGpApXpGpApGpApApGpG(14)CpApGpApGpGpXpGpApApGpCpGpApA(15)GpApCpGpXpGpCpApGpApGpGpXpGpA(16)CpXpGpGpApXpCpCpApApCpXpGpGpX(17)GpGpApGpGpCpGpGpApXpXpXpGpCpX(18)ApGpApGpGpApApGpApXpGpApXpApA(19)CpCpCpApGpGpApXpGpApXpGpGpGpA(20)ApApGpApCpApApApApGpApApApApX(21)CpCpCpApGpXpApApApGpXpXpCpCpC(22)CpCpCpApXpApApApApXpXpXpApGpA(23)ApApCpGpApXpGpXpApXpApXpXpXpG(24)CpGpCpCpCpCpGpXpGpGpXpCpGpGpX(25)GpXpXpApCpApGpGpCpGpGpGpGpXpX(26)GpGpApCpXpXpCpXpCpXpCpApApXpX(27)XpGpGpCpCpApApApApXpXpCpGpCpA(28)XpApXpCpGpCpXpGpGpApXpGpXpGpX(29)ApApGpGpXpApXpGpXpXpGpCpCpCpG(30)XpApXpXpCpCpCpApXpCpCpCpApXpC(31)CpCpApXpXpXpGpXpXpCpApGpXpGpG(32)XpGpXpCpXpXpXpGpGpGpXpApXpApC(33)CpXpCpXpGpCpCpGpApXpCpCpApXpA(34)ApCpCpGpXpGpXpGpCpApCpXpXpCpG(35)ApGpGpCpXpGpXpApGpGpCpApXpApA(36)CpCpApGpCpApCpCpApXpGpCpApApC
其中，p指磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键位点；X是尿嘧啶或胸腺嘧啶，腺嘌呤，或胞嘧啶，或鸟嘌呤，或X的糖环选自2
’‑
H，2
’‑
OMe，2
’‑
OCH2CH2OMe或2
’‑
F取代修饰的任何一种核苷或者吗啡啉核苷，肽核苷，锁核苷和开环核苷骨架修饰、糖环修饰和/或碱基修饰核苷进行替换。2.靶向HBV病毒RNA的反义寡核苷酸的NATAC嵌合分子，其特征在于，通过连接臂将核糖核酸酶的激活剂与权利要求1所述的反义寡核苷酸缀合在一起所得到。3.根据权利要求2所述的NATAC嵌合分子，其特征在于，所述的核糖核酸酶L的激活剂是p(A2‑5)
n
，其中，A2‑5为2'
‑
5'磷酸二酯键连接的腺嘌呤rA或者3
‑
OMe和3
‑
F代修饰A；n为3
‑
6的任意整数。4.根据权利要求2所述的NATAC嵌合分子，其特征在于，所述的连接臂是PEG单元(
‑
OCH2CH2‑
)m，其中m为3
‑
6的任意整数，或者所述的连接臂是不同长度的烷基链或者是功能基团偶联的烷基链。5.根据权利要求2所述的NATAC嵌合分子，其特征在于，所述的反义寡核苷酸选自(1)
‑
(36)中的任何一种(1)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
XpXpGpApCpGpApXpApApGpGpGpApG(2)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
GpApXpGpXpGpApXpGpXpXpCpXpCpC(3)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
GpCpGpGpXpApXpXpGpXpGpApGpGpA(4)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
GpXpXpGpGpXpGpApGpXpGpApXpXpG(5)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
ApXpApApCpCpApGpGpApCpApApGpX(6)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
GpGpApXpApCpApXpApGpApGpGpXpX(7)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
XpXpGpApGpApXpCpXpXpCpXpGpCpG(8)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
XpCpCpCpCpApCpCpXpXpApXpGpApG(9)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
CpCpCpApXpCpXpCpXpXpXpGpXpXpX(10)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
GpGpApGpCpCpGpApApApApGpGpXpX(11)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
CpGpGpCpApGpApCpGpGpApGpApApG(12)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
p
‑
L
‑
p
‑
CpCpGpCpGpXpApApApGpApGpApGpG(13)p
‑
(A2
‑
5)n
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤新景，廖梓天，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：