靶向TOR1A蛋白的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学领域，公开了一种靶向TOR1A蛋白的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示。所述sgRNA可特异性地与TOR1A

【技术实现步骤摘要】
靶向TOR1A蛋白的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学领域，涉及一种靶向TOR1A蛋白的sgRNA及其在DYT1肌张力障碍治疗中的应用。

技术介绍

[0002]DYT1肌张力障碍是一种遗传性的孤立性肌张力障碍，表现为持续或间歇性的肌肉收缩导致的不自主运动或姿势异常。从遗传学上讲，这种早发的运动障碍是由TOR1A基因5号外显子的3
‑
bp杂合框内缺失(c.907_909delGAG)引起的，导致TOR1A蛋白(TOR1A
ΔE
)在302或303位失去1个谷氨酸残基。TOR1A是一个普遍表达的AAA+蛋白，定位在内质网(ER)/核包膜(NE)的连续腔内。到目前为止，TOR1A的生物学作用尚未完全阐明，然而，它已发现参与到各种生物学功能中，包括作为分子伴侣的蛋白质质量控制、与调控ER应急及相关的PERK
‑
eIF2α信号传导、调节核骨架和细胞骨架(LINC)复合体和细胞极性、核孔的生物生成、膜平衡和核质运输、突触囊泡循环和大核糖核蛋白颗粒通过NE排出到细胞膜等等。
[0003]其中许多功能可能涉及ER中的蛋白质相互作用。研究表明，TOR1A
ΔE
突变通过损害TOR1A的功能以多种方式发挥作用。AAA+蛋白一般是通过多聚体的形式发挥功能的。研究发现TOR1A分别与LAP1(NE上)和LULL1(ER上)相互作用形成一个六聚体并触发ATP水解和分解，以此发挥其酶活性，这也被晶体结构所证实。具体来说，TOR1A的C端区域在TOR1A/LULL1和TOR1A/LAP1六聚体内部发挥作用，而ΔE突变体导致它们的结合不稳定，从而导致其ATP酶的活性降低。
[0004]DYT1肌张力障碍是由TOR1A
ΔE
突变的功能丧失(单倍体剂量不足)还是显性负效应(dominant
‑
negative)所引起的目前仍有争议。不过，显性负效应确实参与了DYT1的病理过程。例如，TOR1A
ΔE
在NE中积累，导致形成被称为球状体的NE源性膜性包裹体。TOR1A
ΔE
过量表达导致野生型(WT)TOR1A被招募进入球状体，而通过选择性地沉默TOR1A
ΔE
可以抑制这一过程，从而恢复其正常的亚细胞定位和功能。同样，蛋白质质量控制机制也被TOR1A
ΔE
抑制，导致核周围泛素(Ubiquitin)的异常积累。此外，TOR1A促进了细胞核中复制的单纯疱疹病毒(HSV)衣壳穿越NE进入细胞膜并离开细胞，而内源性水平的TOR1A
ΔE
干扰了这一过程。通过基因组编辑突变等位基因明显使正常TOR1A活性增加，并恢复了其在DYT1成纤维细胞中促进HSV复制的功能。为进一步支持其显性负效应，以往研究也证明了用小干扰RNA(siRNA)或反义寡核苷酸(ASO)选择性地沉默TOR1A突变体的mRNA可以使DYT1表型恢复正常。
[0005]前期已有现有技术对TOR1A突变等位基因开展特异性靶向的尝试，但所使用的SpCas9
‑
VRQR和sgRNA对鉴别突变和WT两个等位基因的特异性较低。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种靶向TOR1A蛋白的sgRNA，该sgRNA可特异与TOR1A
ΔE
等位基因序列结合，继而被NmCas9结合，导致TOR1A
ΔE
突变序列被切割而丧失编码能力。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]靶向TOR1A蛋白的sgRNA，该sgRNA可特异与TOR1A
ΔE
等位基因序列结合，继而被NmCas9结合。
[0009]作为一种优选方式，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示。
[0010]如SEQ ID NO.1所示的sgRNA命名为sgMut
‑
Nm21，sgMut
‑
Nm21为识别NmCas9的PAM位点之前21个核苷酸，其序列与野生型TOR1A核苷酸序列相比存在3
‑
nt的错配。
[0011]sgMut
‑
Nm21核苷酸序列与TOR1A
ΔE
核苷酸序列完全匹配。
[0012]如SEQ ID NO.2所示的sgRNA命名为sgMut
‑
Nm24，sgMut
‑
Nm24为识别NmCas9的PAM位点之前24个核苷酸，其序列与野生型TOR1A核苷酸序列相比存在3
‑
nt的错配。
[0013]sgMut
‑
Nm24核苷酸序列与TOR1A
ΔE
核苷酸序列完全匹配。
[0014]如SEQ ID NO.16所示的sgRNA命名为sgMut
‑
Nm23，sgMut
‑
Nm23为识别NmCas9的PAM位点之前23个核苷酸，其序列与野生型TOR1A核苷酸序列相比存在3
‑
nt的错配。
[0015]sgMut
‑
Nm23核苷酸序列与TOR1A
ΔE
核苷酸序列完全匹配。
[0016]所述靶向TOR1A蛋白的sgRNA可特异与TOR1A
ΔE
等位基因序列结合，继而被NmCas9结合，导致TOR1A
ΔE
突变序列被切割而丧失编码能力。
[0017]编码NmCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述NmCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0018]一种重组质粒或重组病毒，包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示的sgRNA。
[0019]一种大肠杆菌，包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示的sgRNA；或重组质粒、或重组病毒。
[0020]基于同样的专利技术创造，本专利技术还要求保护所述靶向TOR1A蛋白的sgRNA、所述重组质粒或重组病毒、或所述大肠杆菌在制备治疗DYT1肌张力障碍的药物中的应用。
[0021]作为一种优选方式，所述靶向TOR1A蛋白的sgRNA特异性与TOR1A
ΔE
等位基因序列结合，继而被NmCas9结合，导致TOR1A
ΔE
突变序列被切割而丧失编码能力。
[0022]编码NmCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述NmCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0023]基于同样的专利技术创造，本专利技术还要求保护一种试剂盒，所述试剂盒包括所述靶向TOR1A蛋白的sgRNA、所述重组质粒或重组病毒、或所述大肠杆菌。
[0024]本专利技术还要求保护所述试剂盒在制备治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向TOR1A蛋白的sgRNA，其特征在于，该sgRNA可特异与TOR1A
ΔE
等位基因序列结合，继而被NmCas9结合。2.根据权利要求1所述的靶向TOR1A蛋白的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示。3.一种重组质粒或重组病毒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示的sgRNA。4.一种大肠杆菌，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.16所示的sgRNA，或重组质粒、或重组病毒。5.如权利要求1或2所述的靶向TOR1A蛋白的sgRNA、如权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐宇，吴俊娇，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：