一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术还提供了一种靶向小鼠Mybpc3基因的gRNA，所述gRNA的核苷酸序列包括：gRNA

【技术实现步骤摘要】
一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及疾病动物模型的制备方法，具体涉及一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法及其应用，尤其涉及一种肥厚型心肌病动物模型的构建方法，特别是Mybpc3基因移码突变c.3636delT的肥厚型心肌病小鼠模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种流行于全球的遗传性心脏疾病，其主要临床症状从呼吸困难到胸痛、胸闷、甚至发生心源性猝死和致命性心律失常。HCM主要病理特征为左心室肥厚、双心室、心肌壁或室间隔增厚。HCM可在任何年龄发病，是青少年及年轻运动员猝死的最主要原因之一。HCM本质特征是心肌细胞代偿性肥厚，而非心肌细胞数目增多。正常情况下，心肌细胞规则地组装成平行排列的直线束肌纤维，但肥厚心肌的肌纤维短宽肥厚，排列紊乱。目前对HCM患者的治疗，除心脏移植外，没有彻底的治疗方法。大规模的流行病学调查数据显示，HCM在全球普通人群中的发病率不少于1/500。
[0003]HCM的分子遗传学基础为基因突变，其发病多以家族集聚方式出现，主要遵循常染色体显性遗传模式。HCM具有典型的遗传异质性，即不同的突变位点的疾病机制、临床上的发病年龄、病程进展、病情严重程度、预后以及复发风险等都可能不同。因此，针对不同的突变位点进行疾病机制研究及药物筛选尤为重要。近年来国内外对HCM心肌肥厚的疾病分子机制有一定的认识，但由于与HCM发病相关的基因及突变位点多样化，其疾病机制还不完全清楚。到目前为止，已经发现超过30个致病基因和约1400个致病性突变位点与HCM发病相关。在这些与HCM发病相关的致病基因中，致病率最高的主要集中在与肌节蛋白编码相关的基因上，其中编码心肌肌球蛋白结合蛋白C的基因Mybpc3为HCM最主要的致病基因之一(记载于文献：赵跃,张宏,夏雪山.下一代半导体测序技术在遗传性心肌病分子诊断中的应用[J].遗传,2015,37(7):10)。Mybpc3基因位于横纹肌横桥区，是横纹肌粗肌丝的重要组成部分，对肌节的结构完整性有重要作用。Mybpc3基因突变后，导致心肌细胞出现明显代偿性肥厚，心脏组织表现出整个心脏变大，心肌壁或室间隔变厚等肥大特征。
[0004]对疾病机制的研究，是治疗、预防和有效药物研发的前期基础。在人类HCM患者心肌组织不易获得、可复制性差且受医学伦理制约的情况下，导致了HCM的疾病机制研究及药物的研发进展缓慢。更重要的是肌节基因突变与HCM的发病具有明显的临床表型及遗传异质性，也就意味着同一肌节基因不同的突变位点导致HCM的发病机制可能不同，其结果是导致HCM的疾病进展、病情严重程度、预后以及复发风险等都可能不同，这也是导致临床上HCM治疗效果不理想，死亡率较高的重要原因。因此，构建可复制、多样化的基因修饰动物或多功能干细胞模型成为了研究疾病机制及药物筛选的重要工具。中国专利文献(申请号：201811249586.X)公布了肥厚型心肌病小鼠模型的制备方法及其应用，该方法定向Mybpc3基因T2535G位点由碱基T突变为碱基G，得到肥厚型心肌病小鼠模型。中国专利文献(申请号：202010870802.3)公布了一种携带c.3369
‑
3370insC突变的HCM特异性诱导多能干细胞
系。但是关于Mybpc3基因移码突变c.3636delT的小鼠肥厚型心肌病模型目前还未见报道。
[0005]Mybpc3为HCM最重要的致病基因之一，其在HCM发生发展过程中的疾病机制还不完全清楚，其主要原因是Mybpc3基因突变位点的多样化产生的临床表型及遗传异质性，即缺乏携带不同突变位点的实验动物模型。因此，为解决上述Mybpc3基因修饰小鼠多样化严重不足的问题，开发一种新的Mybpc3基因移码突变c.3636delT的HCM小鼠模型，这对于HCM疾病机制的研究和靶向药物的研发具有非常重要的科学价值及临床意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法及其应用。本专利技术采用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法，这对肥厚型心肌病疾病机制的研究及靶向药物研发具有重要的应用价值。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种靶向小鼠Mybpc3基因的gRNA，所述gRNA的核苷酸序列包括：
[0009]gRNA
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A1SEQIDNO.1；
[0010]gRNA
‑
B1SEQIDNO.2。
[0011]SEQIDNO.1：TCCGAGGTAGTCCTAAGGTAGGG。
[0012]SEQIDNO.2：TGCTGTCCGAGGTAGTCCTAAGG。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种靶向小鼠Mybpc3基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括第一方面所述的靶向小鼠Mybpc3基因的gRNA。
[0014]优选地，所述基因编辑系统还包括Cas9mRNA和同源重组DonorDNA。
[0015]优选地，所述同源重组DonorDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。
[0016]SEQIDNO.3：
[0017]CAAATCGCTCCATCATTGCAGGCTATAATGCCATCCTCTGCTGTGCTGTCCGAGGTAGTCC—AAGGTAGGGACTCAAGGTCCTGGGCTAGACTGACAGGAGGCTGGTCTCCTAGGCTCCTTAT。
[0018]其中“—”为需要突变的靶位点。
[0019]本专利技术中，Mybpc3(myosinbindingproteinC3)基因编码心肌肌球蛋白结合蛋白C3，所述Mybpc3基因移码突变(c.3636delT)位于小鼠Mybpc3基因的32号外显子上，也即为Mybpc3(GenBankNo.NM_008653.2)基因的蛋白质编码区(Codingsequence，CDS)第3636位。
[0020]第三方面，本专利技术提供一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
[0021](1)构建第二方面所述的靶向小鼠Mybpc3基因的基因编辑系统；
[0022](2)利用所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，将编辑后的受精卵移植到假孕母鼠体内，出生小鼠，得到F0代小鼠，筛选阳性F0代杂合突变型小鼠，记为Mybpc3
+/
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，Het；
[0023](3)将阳性F0代杂合突变型小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代小鼠，筛选阳性F1代杂合突变型小鼠，记为Mybpc3
+/
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，Het；
[0024](4)将阳性F1代杂合突变型小鼠进行异性杂交，筛选得到稳定遗传的F2代纯合型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向小鼠Mybpc3基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列包括：gRNA
‑
A1SEQIDNO.1；gRNA
‑
B1SEQIDNO.2。2.一种靶向小鼠Mybpc3基因的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向小鼠Mybpc3基因的gRNA。3.根据权利要求2所述的靶向小鼠Mybpc3基因的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统还包括Cas9mRNA和同源重组DonorDNA；优选地，所述同源重组DonorDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.一种Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(1)构建权利要求2或3所述的靶向小鼠Mybpc3基因的基因编辑系统；(2)利用所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，将编辑后的受精卵移植到假孕母鼠体内，出生小鼠，得到F0代小鼠，筛选阳性F0代杂合突变型小鼠，记为Mybpc3
+/
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，Het；(3)将阳性F0代杂合突变型小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代小鼠，筛选阳性F1代杂合突变型小鼠，记为Mybpc3
+/
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，Het；(4)将阳性F1代杂合突变型小鼠进行异性杂交，筛选得到稳定遗传的F2代纯合型突变小鼠，记为Mybpc3
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/
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，Hom。5.根据权利要求4所述的Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠受精卵的供体为C57BL/6N小鼠。6.根据权利要求4或5所述的Mybpc3基因移码突变的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述阳性F0代杂合突变型小鼠、阳性F1代杂合突变型小鼠和F2代纯合型突变小鼠采用包括如下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵跃，黎江溪，张世梅，王玉鑫，
申请(专利权)人：大理大学，
类型：发明
国别省市：