一种具有碱基突变的同向重复序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因编辑领域，特别是成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种具有碱基突变的同向重复序列，包含所述具有碱基突变的同向重复序列的gRNA可以改善Cas酶的活性。向重复序列的gRNA可以改善Cas酶的活性。向重复序列的gRNA可以改善Cas酶的活性。

【技术实现步骤摘要】
一种具有碱基突变的同向重复序列及其应用
[0001]本专利技术为申请日2021年6月8日，名称为“一种具有碱基突变的同向重复序列及其应用”的中国专利申请CN 2021106359893的分案申请。


[0002]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR/Cas)
具体而言，本专利技术涉及一种具有碱基突变的同向重复序列及其应用，尤其涉及一种包含具有碱基突变的同向重复序列的适用于Cas12蛋白家族的gRNA及其应用。

技术介绍

[0003]CRISPR/Cas系统是细菌体内的获得性免疫系统,是用来对抗侵略细菌的外源DNA、质粒和噬菌体的。利用CRISPR/Cas系统进行基因编辑，具有精准、廉价、易于使用的特点，现广泛应用于基因工程中。
[0004]CRISPR/Cas系统分为3类，最常用的是第2类CRISPR/Cas系统，其可编程单效应核酸酶成为基因编辑和核酸检测的便捷工具。第2类CRISPR/Cas系统中的单效应核酸酶
‑
Cas蛋白能够在向导RNA的引导下对核酸进行切割，切割位点主要位于PAM附近。向导RNA是指，crRNA和tracrRNA通过碱基配对形成的双链RNA，或者通过人工改造将crRNA和tracrRNA组合成一个gRNA,这个向导RNA行使引导功能的必要条件是形成茎环结构。茎环结构是向导RNA与Cas酶结合的骨架区。第2类CRISPR/Cas系统分为Ⅱ型、
Ⅴ
型和
Ⅵ
型，分别基于Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白，其中
Ⅴ
型CRISPR/Cas系统的Cas12蛋白具有特异性的cis切割活性和非特异性的trans切割活性，这种活性为核酸检测或临床诊断提供了新的研究思路。
[0005]为了改善Cas酶的活性，本申请专利技术人针对gRNA，尤其是对gRNA的同向重复序列的茎环结构进行了优化，获得了可以提高Cas酶的trans切割活性与cis切割活性比例的gRNA。

技术实现思路

[0006]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，发现了一种可以改善Cas酶活性的gRNA。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种相对于亲本同向重复序列具有碱基突变的同向重复序列，所述亲本同向重复序列和具有碱基突变的同向重复序列可形成茎环结构，所述茎环结构能够与Cas蛋白结合，亲本同向重复序列和具有碱基突变的同向重复序列包括从5
’
到3
’
端依次连接的第一区段、第二区段、第三区段、第四区段，所述第二区段和第四区段可以通过碱基配对形成茎环结构的茎区；
[0008]所述具有碱基突变的同向重复序列的茎区相对于亲本同向重复序列的茎区存在至少1个不配对的碱基对；优选的，所述具有碱基突变的同向重复序列的茎区相对于亲本同向重复序列的茎区存在1个不配对的碱基对。
[0009]本专利技术中，所述同向重复序列是构成gRNA的重要部分，本领域知晓，gRNA通常包括同向重复序列(DR)以及靶向靶核酸的引导序列；同向重复序列也称为gRNA的骨架区，其可
以与Cas蛋白相互作用或结合，从而将Cas蛋白引导至靶核酸的靶向区。
[0010]在一个实施方式中，所述的亲本同向重复序列和具有碱基突变的同向重复序列的第二区段、第四区段分别包括4
‑
10个碱基；优选的，所述的第二区段、第四区段分别包括5个碱基。
[0011]在一个实施方式中，所述同向重复序列形成的茎环结构可以与V型Cas蛋白结合；优选的，所述V型Cas蛋白选自Cas12家族的Cas蛋白，例如，Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12g、Cas12i、Cas12j等。
[0012]在一个实施方式中，所述具有碱基突变的同向重复序列的第二区段和第四区段的任意1个碱基相对于亲本同向重复序列产生突变，从而导致所述具有碱基突变的同向重复序列的茎区相对于亲本同向重复序列的茎区存在1个不配对的碱基对。
[0013]在一个实施方式中，所述亲本同向重复序列的第二区段和第四区段从5
’
到3
’
端的序列分别为GUGUG和CACAC；进一步的，所述亲本同向重复序列的第一区段和第三区段从5
’
到3
’
端的序列分别为AGAGAAU和CAUAGU。
[0014]在优选的实施方式中，所述具有碱基突变的同向重复序列相对于亲本同向重复序列，在对应于SEQ ID NO.1的以下位置的核苷酸具有一种或多种突变：G8、U9、G10、U11、G12、C19、A20、C21、A22、C23；优选的，具有碱基突变的同向重复序列相对于亲本同向重复序列，具有在对应于SEQ ID NO.1的序列的以下位置的一种或多种碱基突变：C19G、A20U、C21G、A22U、C23G。
[0015]在优选的实施方式中，所述具有碱基突变的同向重复序列包括SEQ ID No.2
‑
6任一所示的序列；优选的，所述同向重复序列如SEQ ID No.2
‑
6任一所示的序列。
[0016]另一方面，本专利技术提供了一种gRNA，所述gRNA包括上述具有碱基突变的同向重复序列和与靶核酸杂交的导向序列(或者，称之为引导序列)；
[0017]优选的，所述gRNA包括从5
’
到3
’
端依次连接的上述具有碱基突变的同向重复序列和与靶核酸杂交的导向序列。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种核酸，所述核酸编码上述gRNA，或者编码上述gRNA的前体，或者编码上述具有碱基突变的同向重复序列。
[0019]另一方面，本专利技术提供了一种组合物或CRISPR系统，所述的组合物或CRISPR系统包括上述gRNA和Cas蛋白。
[0020]另一方面，本专利技术提供了一种活化的CRISPR复合物，所述复合物包括上述gRNA、Cas蛋白，以及结合在上述gRNA上的靶核酸。
[0021]另一方面，本专利技术提供了一种载体，所述的载体包括上述gRNA或上述核酸。
[0022]另一方面，本专利技术提供了一种载体系统，所述载体系统包括一种或多种载体，所述一种或多种载体包括：
[0023](i)第一调控元件，该第一调控元件与上述gRNA可操作地连接，
[0024](ii)第二调控元件，该第二调控元件与Cas蛋白可操作地连接；
[0025]其中组分(i)和(ii)位于相同或不同载体上。
[0026]另一方面，本专利技术提供了上述gRNA在改善Cas蛋白的活性中的应用；优选的，所述改善Cas蛋白的活性为提高Cas蛋白的trans切割活性与cis切割活性的比例。
[0027]本领域知晓，Cas蛋白，尤其是V型Cas蛋白(例如，Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j)
在进行基因编辑时，可以表现出cis切割活性，也可以表现出trans切割本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种相对于亲本同向重复序列具有碱基突变的同向重复序列，所述亲本同向重复序列和具有碱基突变的同向重复序列可形成茎环结构，所述茎环结构能够与Cas蛋白结合，亲本同向重复序列和具有碱基突变的同向重复序列包括从5
’
到3
’
端依次连接的第一区段、第二区段、第三区段、第四区段，所述第二区段和第四区段可以通过碱基配对形成茎环结构的茎区；其特征在于，所述具有碱基突变的同向重复序列的茎区相对于亲本同向重复序列的茎区存在至少1个不配对的碱基对。2.根据权利要求1所述的具有碱基突变的同向重复序列，其特征在于，所述的亲本同向重复序列和具有碱基突变的同向重复序列的第二区段、第四区段分别包括4
‑
10个碱基；优选的，所述的第二区段、第四区段分别包括5个碱基。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的具有碱基突变的同向重复序列，其特征在于，所述茎环结构能够与V型Cas蛋白结合；优选的，所述V型Cas蛋白选自Cas12家族的Cas蛋白。4.根据权利要求3所述的具有碱基突变的同向重复序列，其特征在于，所述具有碱基突变的同向重复序列的第二区段和第四区段的任意1个碱基相对于亲本同向重复序列产生突变。5.一种gRNA，其特征在于，所述gRNA包括(i)权利要求1
‑
4任一所述的具有碱基突变的同向重复序列；和(ii)与靶核酸杂交的导向序列；优选的，包括从5
’
到3
’
端依次连接的(i)权利要求1
‑
4任一所述的具有碱基突变的同向重复序列；和(ii)与靶核酸杂交的导向序列。6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求5所述的gRNA，或者编码权利要求5所述的gRNA的前体，或者编码权利要求1
‑
4任一所述的具有碱基突变的同向重复序列。7.一种组合物或CRISPR系统，其特征在于，所述的组合物或CRISPR系统包括权利要求5所述的gRNA和Cas蛋白。8.一种活化的CRISPR复合物，其特征在于，所述复合物包括权利要求5所述的gRNA、Cas蛋白，以及结合在所述gRNA上的靶核酸。9.一种载体，其特征在于，所述的载体包括权利要求5所述的gRNA或权利要求6所述的核酸。10.一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，所述一种或多种载体包括：(i)第一调控元件，该第一调控元件与权利要求5所述的gRNA可操作地连接，(ii)第二调控元件，该第二调控元件与Cas蛋白可操作地连接；其中组分(i)和(ii)位于相同或不同载体上。11.权利要求5所述的gRNA在改善Cas蛋白的活性中的应用；优选的，所述改善Cas蛋白的活性为提高Cas蛋白的trans切割活性与cis切割活性的比例。12.一种改善Cas蛋白活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：