一种促进脊髓损伤后轴突再生的工程化外泌体、制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种促进脊髓损伤后轴突再生的工程化外泌体、制备方法与应用，涉及生物医学技术领域，所述工程化外泌体为人经血干细胞源性外泌体miR

【技术实现步骤摘要】
一种促进脊髓损伤后轴突再生的工程化外泌体、制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种促进脊髓损伤后轴突再生的工程化外泌体、制备方法与应用。

技术介绍

[0002]全世界每年因车祸、暴力以及跌落等原因导致的脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)患者约25
‑
50万人。这一严重的致残性疾病会导致损伤平面以下感觉和运动功能障碍，并因此产生神经病理性疼痛、痉挛、褥疮以及膀胱和肠道功能障碍等并发症，患者的生活质量严重下降。脊髓损伤过程复杂，早期以轴突、少突胶质细胞和神经元凋亡和缺失为主；继而破坏血脑屏障，诱发大量炎性细胞浸润；后期在损伤部位产生空洞、胶质瘢痕、髓鞘脱落而诱导远端神经元萎缩和凋亡，并且阻断轴突的再生，限制功能恢复。手术治疗、药物治疗、康复治疗等是目前临床上治疗脊髓损伤的主要方案，但皆不能有效逆转受损脊髓的病理程度，影响功能恢复。因此，积极探索SCI治疗新方案具有重要的理论意义与临床转化价值。
[0003]经血干细胞(Menstrual blood
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derived mesenchymal stem cells，MenSCs)在2007年被首次从女性月经期间脱落的子宫内膜中分离出来，因其来源丰富，采集方式无创、安全、方便，具有较强的多向分化潜能，增殖活性高且遗传稳定性强，自体移植伦理风险低，定向分化为神经元能力强，免疫调节和神经营养因子分泌能力强，逐步成为治疗中枢神经系统疾病的“潜力股”。与骨髓干细胞、脐带干细胞、羊膜干细胞外泌体相比，MenSCs外泌体孵育后皮层神经元长度最长，对背根神经元生长刺激效果与骨髓干细胞相近，优于其他干细胞。
[0004]外泌体是具有脂质双层膜的细胞外颗粒，直径约30～150nm，可以直接将特定效应物，如蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等从分泌细胞传递到受体细胞。与特化的终末分化细胞相比，间充质干细胞的外泌体释放量更高。然而，与干细胞相比，外泌体获取存储便利，伦理限制低，能够穿透血
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脊髓屏障，具有更低的免疫原性和非整倍性风险，临床应用更为便利。已有报道表明间充质干细胞分泌的外泌体广泛应用于脊髓损伤后治疗，降低神经细胞凋亡和组织损伤，抑制炎症反应，减少瘢痕面积，促进轴突再生和神经环路重建，改善肢体功能。
[0005]外泌体因其良好的生物组织相容性、稳定性、低免疫原性和工程化便利性逐渐成为损伤修复“非细胞治疗(Cell
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free therapy)”首选方案。但目前尚无有关经血干细胞源性外泌体用于脊髓损伤治疗领域的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决现有技术中针对经血干细胞源型外泌体用于脊髓损伤治疗
并无相关研究的技术问题。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0008]本申请提供了一种人经血干细胞源性外泌体miR
‑
421，其特征在于：所述miR
‑
421
的前提核苷酸序列如Seq ID No.1所示,其成熟编码序列如Seq ID No.2所示。
[0009]本申请还提供了外泌体miR
‑
421在制备用于治疗脊髓损伤轴突再生和功能恢复过程中药物中的应用。
[0010]优选的，所述miR
‑
421能够促进脊髓损伤后运动感觉功能的恢复，促进轴突再生，降低胶质瘢痕。
[0011]本申请还提供了一种miR
‑
421过表达工程化外泌体的制备方法，所述制备方法为电穿孔技术。
[0012]优选的，所述制备方法包含以下步骤：
[0013]S1：采用同源重组发构建表达Seq ID No.1的慢病毒颗粒，分装冻存
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80℃备用；
[0014]S2：于12孔板中按照1*105个细胞/ml接种细胞，待其汇合率达到70
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80％时，按照细胞数量：病毒颗粒数量等于0.5、1.0、1.5加入慢病毒，然后混匀；
[0015]S3：24h后换液，72h观察感染效率，若感染效率高于40％则按照终浓度1μg/mL剂量加入嘌呤霉素，每2天更换一次，持续至少14天，感染效率达到100％。
[0016]S4：冻存细胞并基座P0代，其余细胞继续扩增培养；
[0017]S5：用15cm培养皿接种P3
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P10代MenSCs，常规培养至汇合率约70％，去除旧培养液，无外泌体PBS洗涤2次，添加DMEM F12于37℃，5％的CO2条件下培养48h，收集上清，冻存于
‑
80℃备用；
[0018]S6：上清经过梯度差速离心处理获得外泌体。
[0019]优选的，所述S5中DMEM F12含3％胎牛血清，不含有外泌体。
[0020]优选的，所述S6的具体步骤为：
[0021]首先S5中获得的上清经过4℃，2000rpm离心25min，弃去沉淀，保留上清；随后在4℃，10000rpm离心40min，弃去沉淀，保留上清；接着在4℃，1
×
105rpm离心150min，弃去上清，保留沉淀，所述沉淀即为外泌体，将外泌体用适量PBS(pH＝7.5)重悬并保存在
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80℃备用。
[0022]本申请中基于全基因转录组测序技术，筛选出差异表达的miRNAs，通过生信和在体实验锁定关键分子miR
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421。发现miR
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421能够促进脊髓损伤后大鼠运动感觉功能的恢复，促进轴突再生，降低胶质瘢痕。本专利技术通过电穿孔技术制备miR
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421过表达工程化外泌体，制备方法效率高，技术可推广程度高且能迅速制备大量不同类型外源物质的外泌体，具有极高的应用价值。本专利技术为脊髓损伤治疗提供了新方案，为临床转化提供支撑。
附图说明
[0023]图1是实施例1的外泌体粒径分析结果；
[0024]图2是实施例1的外泌体颗粒透射电镜结果(Scale bar＝100nm)；
[0025]图3是实施例1中外泌体颗粒标记物的表达；
[0026]图4是实施例2中外泌体颗粒在神经元细胞中的内吞情况；
[0027]图5是实施例2中HT22神经元细胞中miR
‑
421的表达；
[0028]图6是实施例2中原代脊髓神经元细胞中miR
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421表达；
[0029]图7是实施例2中外泌体调控原代脊髓神经元存活；
[0030]图8是实施例3中外泌体颗粒在SCI大鼠脊髓内分布情况；
[0031]图9是实施例3中SCI大鼠损伤局部脊髓组织中miR
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421的表达；
[0032]图10是实施例3中BBB评分体系评估SCI大鼠后肢运动功能；
[0033]图11是实施例3中H&E、Nissl、Mas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人经血干细胞源性外泌体miR
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421，其特征在于：所述miR
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421的前提核苷酸序列如Seq ID No.1所示,其成熟编码序列如Seq ID No.2所示。2.外泌体miR
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421在制备用于治疗脊髓损伤轴突再生和功能恢复过程中药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述miR
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421能够促进脊髓损伤后运动感觉功能的恢复，促进轴突再生，降低胶质瘢痕。4.一种miR
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421过表达工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法为电穿孔技术。5.根据权利要求4所述的miR
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421过表达工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包含以下步骤：S1：采用同源重组发构建表达Seq ID No.1的慢病毒颗粒，分装冻存
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80℃备用；S2：于12孔板中按照1*105个细胞/ml接种细胞，待其汇合率达到70
‑
80％时，按照细胞数量：病毒颗粒数量等于0.5、1.0、1.5加入慢病毒，然后混匀；S3：24h后换液，72h观察感染效率，若感染效率高于40％则按...

【专利技术属性】
技术研发人员：居丁玥，王庆华，戚龙菊，董传明，廖泽华，蒋逢辰，刘晋宜，喻姝敏，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：