靶向UTY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了靶向UTY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系及其应用。具体地公开了靶向UTY基因的sgRNA，其靶序列为SEQ ID No.1。本发明专利技术还公开了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，包括利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的UTY基因的靶点中的步骤。本发明专利技术在山羊成纤维细胞中筛选了UTY基因内含子上的高效sgRNA，并在该位点采用HMEJ方法介导的重组定点整合了tdTomato基因，获得了标记Y染色体的绵羊成纤维细胞，该细胞能够结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊，从而用于分离XY精子，最终用于性别控制。最终用于性别控制。

【技术实现步骤摘要】
靶向UTY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及靶向UTY基因的sgRNA和利用其整合外源基因的绵羊成纤维细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas是原核生物抵御病毒感染或噬菌体入侵产生的一种适应性免疫系统，其主要通过适应、表达、干扰3个基本阶段来保护细菌免受病毒反复攻击。自被发现以来，研究人员不断对CRISPR/Cas系统进行优化升级，使其成为了分子生物学领域重要的基因编辑工具之一，其主要通过特异位点识别、靶标基因切割和修复3个步骤实现基因编辑。由于Ⅱ型CRISPR/Cas9基因编辑系统组成相对简单，操作简便，编辑效率高，在基因编辑中得到了广泛的研究和应用。Cas9蛋白本质上是一种DNA核酸内切酶，负责切割目的基因形成双链断裂，也被称为遗传剪刀。Cas9蛋白在PAM序列上游的3bp处对DNA进行切割，产生一个平末端双链断裂，随后目标基因通过非同源末端连接途径或同源定向修复途径进行修复，从而导致序列插入或删除。CRISPR/Cas9技术突破了传统育种的局限性，可在较短时间内培育出传统育种方法无法育成或难以育成的动物品种，从而加快动物遗传改良进展。
[0003]性别控制技术在畜牧生产中有着重要的意义。首先，通过控制后代的性别比例，可充分发挥受性别限制的生产性状(如泌乳)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)的最大经济效益。其次，控制后代的性别比例可增加选种强度，加快育种进程。性别控制可以通过精子分离来实现。Y染色体连锁的四肽重复基因(ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene Y
‑
linked，UTY)是动物Y染色体上的单拷贝基因，编码组蛋白去甲基化酶，编码蛋白同时也是一种次要的组织相容性抗原。与精子生成相关，也被用于探究家畜分子遗传多样性、群体结构和起源等。研究和开发针对该基因高效的定点整合转基因技术，构建定点整合外源DNA的转基因细胞系，可实现XY精子的分离，最终实现性别控制，极大地减少畜禽分子育种年限，对推动现代畜禽养殖技术的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种打靶效率高的特异性靶向UTY基因的sgRNA，和/或，提供一种定点整合外源基因的细胞系及其构建方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术首先提供了靶向UTY基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列可为SEQ ID No.1。
[0006]所述sgRNA的靶序列位于UTY基因的内含子上；所述sgRNA可基于CRISPR/Cas9系统。
[0007]所述UTY基因的核苷酸序列可为GenBank Accession No.CM022046.1的第841124
‑
841340位(Update Date 27
‑
JAN
‑
2020)。
[0008]本专利技术还提供了编码所述sgRNA的DNA分子。
[0009]本专利技术还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
[0010]B1)含有所述DNA分子的表达盒；
[0011]B2)含有所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
[0012]B3)含有所述sgRNA或所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
[0013]B4)含有所述sgRNA或所述DNA分子的重组宿主细胞、或含有B1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有B2)所述重组载体的重组宿主细胞。
[0014]上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0015]上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。
[0016]上述生物材料中，所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的，所述动物细胞可为哺乳动物细胞。在本专利技术的一个或多个实施方案中，所述哺乳动物细胞为绵羊成纤维细胞或山羊成纤维细胞。
[0017]本专利技术还提供了所述sgRNA，或所述DNA分子，或所述生物材料的下述任一种应用：
[0018]A1)在特异性识别和/或靶向UTY基因中的应用；
[0019]A2)在UTY基因中定点整合外源基因中的应用；
[0020]A3)在制备UTY基因中定点整合外源基因的细胞系中的应用；
[0021]A4)在利用基因编辑技术对绵羊或山羊Y染色体进行标记中的应用；
[0022]A5)在绵羊或山羊XY染色体分离中的应用；
[0023]A6)在控制绵羊或山羊性别或制备用于控制绵羊或山羊性别的产品中的应用；
[0024]A7)在制备转基因绵羊或山羊中的应用；
[0025]A8)在绵羊或山羊分子育种中的应用；
[0026]A9)在制备UTY基因功能研究细胞模型或动物模型中的应用。
[0027]所述控制绵羊或山羊性别的方法包括：利用所述sgRNA构建在绵羊或山羊成纤维细胞UTY基因中定点整合报告基因(如tdTomato基因)的细胞系，利用该细胞系结合体细胞核移植技术获得转基因绵羊或山羊，根据报告基因的表达情况筛选出Y精子，从而分离XY精子，最终实现性别控制。
[0028]本专利技术还提供了一种构建定点整合外源基因的细胞系的方法，所述方法可包括：利用CRISPR/Cas9系统通过HMEJ方法介导的重组将外源基因定点整合到受体细胞的UTY基因的靶点中，所述靶点的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
[0029]进一步地，所述方法可包括如下步骤：
[0030]E1)构建表达所述sgRNA的载体；
[0031]E2)构建含有外源基因和用于与SEQ ID No.1所示的打靶位点两端同源重组的同源臂的供体质粒；
[0032]E3)将E1)所述载体和E2)所述供体质粒共转染受体细胞。
[0033]上述方法中，所述外源基因可为报告基因。
[0034]进一步地，所述报告基因可包括绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、β
‑
半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、荧光素酶基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向UTY基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。2.编码权利要求1中所述sgRNA的DNA分子。3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：B1)含有权利要求2所述DNA分子的表达盒；B2)含有权利要求2所述DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；B3)含有权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；B4)含有权利要求1所述sgRNA或权利要求2所述DNA分子的重组宿主细胞、或含有B1)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有B2)所述重组载体的重组宿主细胞。4.权利要求1所述的sgRNA，或权利要求2所述的DNA分子，或权利要求3所述生物材料的下述任一种应用：A1)在特异性识别和/或靶向UTY基因中的应用；A2)在UTY基因中定点整合外源基因中的应用；A3)在制备UTY基因中定点整合外源基因的细胞系中的应用；A4)在利用基因编辑技术对绵羊或山羊Y染色体进行标记中的应用；A5)在绵羊或山羊XY染色体分离中的应用；A6)在控制绵羊或山羊性别或制备用于控制绵羊或山羊性别的产品中的应用；A7)在制备转基因绵羊或山羊中的应用；A8)在绵羊或山羊分子育种中的应用；A9)在制备UT...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩红兵，汪林丽，艾越，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：