一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及丝状真菌生物技术及合成生物学领域，具体涉及一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用。启动子为粗糙脉孢霉属RNA聚合酶III启动子；启动子为SEQ ID NO:1，或与上述各序列具有70%同源性、且具有启动子活性的DNA核苷酸序列。本发明专利技术公开的启动子应用于粗壮脉纹孢菌CIRSPR/Cas9系统，指导该系统中gRNA的表达，能够更有效地对粗壮脉纹孢菌进行编辑改造，如通过对孢子发育及类胡萝卜素负调控基因dcc

【技术实现步骤摘要】
一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及丝状真菌生物技术及合成生物学领域，具体涉及一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子及其应用。

技术介绍

[0002]粗壮脉纹孢菌 (Neurospora crassa) 与粗糙脉孢菌同属，通常被作为真核微生物的模式菌株，在遗传、发育和细胞生物学等基础研究领域发挥着不可替代的作用。此外，粗壮脉纹孢菌营养要求低，菌丝生长快，在生产纤维素酶和类胡萝卜素上具有显著的生物活性，在发酵工业及天然产物方面具有广泛的应用前景(Sylvia, E.B., Chun, L., Zhengjie, L., Hao, W., Qin, C., and Zichao, M. Metabolic engineering of Neurospora crassa for increasing carotenoids synthesis. African Journal of Biotechnology (2022), 21, 156
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166.)。类胡萝卜素具有超强的抗氧化能力，兼有抗肿瘤、抗炎症和预防心脑血管疾病作用(Sandmann, G. Carotenoids and their biosynthesis in fungi.molecules (2022), 27, 1431.)，被认为最具有发展潜力的天然产物之一。然而，丝状真菌具有多细胞的结构特点，与酵母等单细胞真菌相比，其生长发育相对复杂，对丝状真菌进行遗传操作相对困难，极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。/>[0003]CRISPR (clustered regulatory interspaced short palindromic repeats) 是一种方便灵活的基因组编辑技术。近年，CRISPR基因编辑技术迅猛发展，目前已经在黑曲霉、嗜热毁丝霉、米曲霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌等多种丝状真菌中发展了该技术。2015年，Matsu
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ura等用来源于构巢曲霉(Aspergillus nidulans) 的trpC基因 (AN0648) 的启动子和终止子来表达Cas9基因，同时利用源自酿酒酵母的SNR52启动子转录sgRNA，通过电击转化将Cas9、sgRNA重组表达盒和供体DNA同时导入宿主细胞，在粗糙脉孢菌中成功编辑基因组，这是较早报道的丝状真菌CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究之一(Matsu
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Ura, T., Baek, M., Kwon, J., and Hong, C. Efficient gene editing in Neurospora crassa with CRISPR technology. Fungal Biol Biotechnol(2015), 2, 1
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7.)。
[0004]伴随着大量不同种属丝状真菌基因组测序工作的完成(Sharma, K.K. Fungal genome sequencing: basic biology to biotechnology. Crit. Rev. Biotechnol(2016), 36, 743
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759.)，丝状真菌基因组编辑技术也得到快速发展，极大地促进了以基因组水平遗传改造为核心的真菌合成生物学研究(Tong, Z., Zheng, X., Tong, Y., Shi, Y.
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C., and Sun, J. Systems metabolic engineering for citric acid production by Aspergillus niger in the post
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genomic era.Biotechnol Biofuels(2019), 18, 1
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15.)。虽然Matsu
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ura等已经在N. crassa中发展了CRISPR/Cas9基因编辑技术，但是其Cas9和gRNA表达元件均由异源启动子指导合成，实际效果仍有待验证。Cas9蛋白和sgRNA表达盒是CRISPR/Cas9系统的两个必备元件，其中，sgRNA的转录水平对Cas9的定位与切割效率有着决定作用(Jiang, L., Li
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zhao, G., and Jian
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ping, X. Research progress on guide RNA in CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Bulletin(2019), 35, 108
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115.)。
获得高效表达的gRNA启动子是丝状真菌CRISPR高效编辑的关键，sgRNA编码DNA的转录由RNA聚合酶III型启动子调控，而可以用来启动sgRNA的编码DNA转录的这类启动子非常缺乏。因此，挖掘和鉴定高效表达的gRNA启动子是实现丝状真菌CRISPR/Cas9系统高效编辑基因组的关键因素。本专利技术针对这一问题，鉴定、克隆、验证了有效的粗壮脉纹孢菌gRNA编码DNA的启动子NcP，并阐述了其在β
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胡萝卜素生产提升方面的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术以黑曲霉snRNA保守序列为参照，通过序列比对，从粗壮脉纹孢菌基因组中鉴定RNA聚合酶III启动子。采用Gibson Assembly装配方法，构建RNA聚合酶III启动子表达框。在CIRSPR/Cas9系统中验证启动子的功能。
[0006]因此，本专利技术的目的是提供一种粗壮脉纹孢菌中具有调控sgRNA编码DNA转录的RNA聚合酶III启动子的DNA片段、及含有该DNA片段的sgRNA表达载体，其组成的基于CRISPR/Cas9的基因组编辑系统及其应用。经验证，本专利技术编辑系统能够显著提高粗壮脉纹孢菌基因组的编辑效率，进而获得遗传性状稳定的基因编辑突变株，显著提高菌株β
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胡萝卜素的产量。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术人经过广泛而深入的研究，在粗壮脉纹孢菌中发现一种启动粗壮脉纹孢菌gRNA表达的启动子，启动子为粗糙脉孢菌属RNA聚合酶III启动子 (命名为NcP)；在后续研究发现该启动子具有转录sgRNA的功能，因而本专利技术提供一种具有调控sgRNA编码DNA转录的启动子功能的DNA片段，其特征在于，含有如SEQ ID NO:1所示序列。该DNA片段可以作为普通启动子使用，但尤其可用于调控sgRNA编码DNA转录的表达载体，以进一步促进CRISPR/Cas9系统在粗壮脉纹孢菌基因组编辑中应用。
[0008]进一步地，所述的启动子功能的DNA片段还包括对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行一个或多个，优选为1至10个中的任何个数的核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列相同的具有sgRNA编码DNA的启动子功能的核苷酸序列或其互补序列或者所述的启动子功能的DNA片段还包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于粗壮脉纹孢菌的启动子，其特征在于：启动子为粗壮脉纹孢菌属RNA聚合酶III启动子；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种含有权利要求1所述启动子的重组表达载体。3.一种如权利要求1所述的启动子在启动RNA表达中的应用，其特征在于，利用如权利要求1所述的启动子在启动CIRSPR基因编辑系统中gRNA的表达、启动snRNA的表达或启动RNA聚合酶III转录产物的表达中的应用。4.一种真核基因组编辑系统，其特征在于，所述系统包括如权利要求1所述的启动子调控的sgRNA编码DNA转录的表达载体和Cas9蛋白的表达载体。5.如权利要求4所述的真核基因组编辑系统，其特征在于，所述的Cas9蛋白的表达载体包括Cas9蛋白的表达框，其包括NcPgpd1启动子，以及启动子调控的Cas9的编码序列。6.如权利要求5所述的真核基因组编辑系统，其特征在于，所述NcPgpd1启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；Cas9蛋白的编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。7.一种重组宿主细胞，包含有如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴信，李晓林，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：