本发明专利技术公开了乳酸片球菌梯度强度启动子及其应用，属于分子生物学领域。本发明专利技术提供具有梯度强度的组成型启动子文库，不需要额外的添加诱导剂，具备较高的转录强度和高翻译强度，同时其具有一定的强度梯度，其中启动子转录强度跨度为7.2倍，启动子翻译强度跨度为5.2倍，可用于对多基因表达途径进行微调。可用于对多基因表达途径进行微调。可用于对多基因表达途径进行微调。
【技术实现步骤摘要】
乳酸片球菌梯度强度启动子及其应用
[0001]本专利技术乳酸片球菌梯度强度启动子及其应用，属于分子生物学领域。
技术介绍
[0002]乳酸片球菌作为一种具有耐高温耐盐特性的益生性乳酸菌，是理想的食品工业发酵菌株。但由于可用于乳酸片球菌基因表达元件的缺少，大大限制了其工业化应用。通过不同强度的启动子调控靶基因的表达水平，可直接调控菌体的代谢流向，是代谢工程领域的常用手段。
[0003]由于诱导型启动子需要添加额外的诱导剂，很多诱导剂对菌体生长有一定的毒性，且大大增加了发酵成本。通过组成型启动子的随机突变策略构建的启动子文库，虽然具有广泛的转录强度，但由于获得的启动子强度具有较高的序列相似性，在多基因表达时容易发生同源重组。也有研究者针对微生物基因组范围内的组成型启动子进行筛选，获得了大量的梯度强度的天然启动子，然而在乳酸片球菌组成型启动子的筛选方面却鲜有报道。存在于基因组中的天然启动子具有广泛的转录强度，且其显示出复杂的序列多样性，能够避免发生同源重组。因此，筛选梯度强度的天然启动子更有利于基因的精细表达。
技术实现思路
[0004]本专利技术提供了可在乳酸片球菌内梯度表达的启动子文库，包括具有梯度表达强度的启动子P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
和P
hpp3
；所述启动子P
ldhL
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子P
clpA
的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述启动子P
ftsA
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述启动子P
hpp3
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0005]在一种实施方式中，所述梯度表达强度是依次减弱乳酸片球菌启动转氨酶基因表达的强度。
[0006]本专利技术还提供所述启动子文库在代谢工程领域的应用。
[0007]在一种实施方式中，所述应用是在乳酸片球菌中梯度调控基因表达强度。
[0008]在一种实施方式中，所述基因包括但不限于转氨酶基因，其基因序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]在一种实施方式中，所述乳酸片球菌以pNZ8148为表达载体，应用SEQ ID NO.1～4任一所述的启动子表达所述转氨酶基因。
[0010]本专利技术还要求保护含有所述启动子的重组乳酸片球菌。
[0011]在一种实施方式中，所述乳酸片球菌包括但不限于乳酸片球菌DY15；所述乳酸片球菌DY15保藏编号为CCTCC NO：M 20211291，已公开于公开号为CN114058543A的专利申请文件中。
[0012]有益效果：本专利技术提供具有梯度强度的组成型启动子，不需要额外的添加诱导剂，具备较高的转录强度和高翻译强度，同时其具有一定的强度梯度(启动子转录强度跨度为7.2倍，启动子翻译强度跨度为5.2倍)可用于对多基因表达途径进行微调。
附图说明
[0013]图1为不同过表达菌株的苯乳酸随时间的产量。
具体实施方式
[0014]材料与方法
[0015]大肠杆菌JM109用于质粒构建。
[0016]乳酸片球菌DY15(保藏编号为CCTCC NO：M 20211291)，已公开于公开号为CN114058543A的专利申请文件中，用于作为宿主表达蛋白以测定启动子强度。
[0017]实施例1
[0018]分析乳酸片球菌DY15的转录组数据，从中筛选一系列的具有高强度表达效果的启动子。以乳酸片球菌DY15基因组为模版，设计引物扩增启动子P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
和P
hpp3
，以载体pMG36e为模板，设计引物扩增启动子P
32
。采用融合PCR的方式融合P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
、P
hpp3
和P
32
和报告基因sfGFP。PCR扩增反应均由高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS(premix)(TaKaRa)扩增，扩增引物见表1。
[0019]表1引物序列
[0020][0021][0022]使用同源重组的方法将融合PCR片段与载体pNZ8148连接，带下划线的碱基序列为同源臂。
[0023]1、转录强度
[0024]将构建的重组菌于MRS培养基中37℃，180rpm条件下培养，培养至对数后期(8h)后于6000rpm，4℃离心收集菌体，提取菌体的总mRNA，反转录后进行RT
‑
qPCR检测，测定sfGFP的胞内mRNA丰度。以sfGFP为报告基因，检测结果显示组成型启动子P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
和P
hpp3
的转录强度分别是标准组成型启动子P
32
的1.73、7.67、2.82和0.28倍。
[0025]2、翻译强度
[0026]为了测定所筛选的组成型启动子P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
和P
hpp3
的翻译强度，以sfGFP为表达基因，于乳酸片球菌DY15对数后期(8h)检测胞内检测胞内sfGFP水平。将重组菌于MRS培养基中37℃，180rpm条件下培养，培养至对数后期(OD≈3.5)后于6000rpm，4℃离心收集菌体，利用PBS(pH＝7.4)缓冲液清洗细胞2次，以除去死菌体、菌体分泌物和培养基沉淀成分从而降低荧光检测背景。将清洗后的菌体至于96孔荧光板中于多功能荧光酶标仪检测荧光强度和菌体OD
600
，检测条件为488nm激发，520nm发射。启动子翻译强度定义为荧光强度于OD
600
的比值。荧光酶标仪检测结果显示翻译强度分别为标准组成型启动子P
32
的1.81，2.21，0.54和0.34倍。
[0027]实施例2启动子在提高苯乳酸产量方面的应用
[0028]为了验证启动子在代谢工程上的应用，将启动子P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
和P
hpp3
与转氨酶AT2基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)融合后的片段，与pNZ8148连接，构建过表达质粒，并在乳酸片球菌DY15中表达，最终得到四株过表达菌株DY15
‑
P
ldhL
，DY15
‑
P
clpA
，DY15
‑
P
ftsA
和DY15
‑
P
hpp3
。
[0029]为了测定过表达菌株的苯乳酸产量，将菌株DY本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.可在乳酸片球菌内梯度表达的启动子文库，其特征在于，包括具有梯度表达强度的启动子P
ldhL
、P
clpA
、P
ftsA
和P
hpp3
；所述启动子P
ldhL
的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子P
clpA
的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述启动子P
ftsA
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述启动子P
hpp3
的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的启动子文库，其特征在于，所述梯度表达强度是依次减弱乳酸片球菌启动基因表达的强度。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因包括但不限于转氨酶基因；所...
【专利技术属性】
技术研发人员：周胜虎，邓禹，贾以泽，毛银，李国辉，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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