一种sgRNA、CRISPR/Cas9载体及其构建方法和用途技术

本发明专利技术属于分子技术领域，具体提供了一种sgRNA、CRISPR/Cas9载体及其构建方法和用途，其中sgRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示的APOE

【技术实现步骤摘要】
一种sgRNA、CRISPR/Cas9载体及其构建方法和用途


[0001]本专利技术属于分子
，具体涉及一种sgRNA、CRISPR/Cas9载体及其构建方法和在APOE和LDLR双等位基因敲除的细胞株中的用途。

技术介绍

[0002]高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein Receptor,LDLR），载脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）是目前高脂血症的主效基因。近年来通过对APOE和LDLR基因编辑，构建高血脂动物模型，用于高血脂症研究不断取得重大发展。例如南京医科大学制备了APOE编辑巴马小型猪，中国农业科学院动物科学研究所制备了APOE和LDLR编辑巴马小型猪，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所制备了PCSK9基因编辑五指山小型猪，这几种编辑猪，在断奶后，自发性血浆胆固醇（TC）水平是野生型的3~5倍，低密度脂蛋白胆固醇（LDL
‑
C）是野生型的2~3倍。
[0003]基因编辑依赖于经过基因工程改造的CRISPR/Cas9，也称“分子剪刀”，可以用它来清除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，为治疗人类疾病提供了广阔的前景。在完全实现基于基因编辑的疾病研究愿景之前，研究人员面临的挑战也长期存在。过去的几十年间，在研究如何递送蛋白质和核酸时，科学人员们专利技术了多种基因传递技术，在基因编辑的过程中发挥了至关重要的作用，包括用于基因治疗的腺相关病毒载体和慢病毒载体，还包括用于递送蛋白质和核酸的脂质纳米粒以及非病毒载体。然而，这些载体的传递效率较为低下，靶向特异组织的能力不足，基因编辑效率低。例如CN113046388A公开了一种用于猪APOE和LDLR基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其对APOE编辑效率最高仅61%，对LDLR基因编辑效率最高仅33%。基因编辑效率低，导致高脂血症动物模型费时费力又费钱。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了一种sgRNA，它包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示的APOE
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sgRNA2，和核苷酸序列如SEQID NO.7或SEQ ID NO.15所示的LDLR
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sgRNA3。
[0005]本专利技术还提供了一种CRISPR/Cas9载体，它是连接有与APOE
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sgRNA2对应的双链DNA的载体，和连接有与LDLR
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sgRNA3对应的双链DNA的载体；所述APOE
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sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示；所述LDLR
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sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQID NO.15所示。
[0006]进一步地，所述载体为pX458质粒载体。
[0007]本专利技术连接有与APOE
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sgRNA2对应的双链DNA的载体可以在细胞内表达生成APOE
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sgRNA2；连接有与LDLR
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sgRNA3对应的双链DNA的载体可以在细胞内表达生成LDLR
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sgRNA3；其中，APOE
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sgRNA2是引导Cas9对APOE基因定点编辑的sgRNA；
LDLR
‑
sgRNA3是引导Cas9对LDLR基因定点编辑的sgRNA。
[0008]本专利技术还提供了一种前述CRISPR/Cas9载体的构建方法，它包括如下步骤：取与APOE
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sgRNA2对应的双链DNA，插入到pX458质粒载体中；取与LDLR
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sgRNA3对应的双链DNA，插入pX458质粒载体中，即得；所述APOE
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sgRNA2的核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.10所示；所述LDLR
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sgRNA3的核苷酸序列如SEQIDNO.7或SEQIDNO.15所示。
[0009]本专利技术还提供了一种前述CRISPR/Cas9载体在制备APOE和LDLR双等位基因敲除的细胞株或动物中的用途。
[0010]进一步地，所述细胞珠包括五指山猪耳成纤维细胞；所述动物包括五指山猪。
[0011]本专利技术还提供了一种APOE和LDLR双等位基因敲除的细胞株的构建方法，它包括如下步骤：取前述CRISPR/Cas9载体共转染五指山猪耳成纤维细胞，富集带绿色荧光细胞并培养，测序鉴定获得APOE和LDLR双等位基因敲除的细胞株。
[0012]本专利技术有益效果为：本专利技术用于APOE和LDLR双等位基因敲除的sgRNA及其应用，通过特定的sgRNA构建的CRISPR/Cas9系统，在APOE或LDLR双等位基因编辑效率均达60%以上，APOE和LDLR两基因双等位基因编辑效率达30%以上，提高了APOE和LDLR双基因编辑效率，降低了APOE和LDLR双等位基因敲除细胞株的构建成本，具体实际推广应用价值。
[0013]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0014]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
附图说明
[0015]图1APOE
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sgRNA编辑效率验证测序结果；图2LDLR
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sgRNA编辑效率验证测序结果；图35个APOE和LDLR两基因双等位基因编辑的单细胞克隆测序结果；图4APOE和LDLR基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞第7天爬出情况；图5APOE和LDLR基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞传后细胞生长情况；图6APOE和LDLR基因编辑克隆五指山猪耳成纤维细胞的发育情况。
具体实施方式
[0016]实施例1ApoE、LDLR双基因编辑细胞系和应用研究1.1设计靶向APOE和LDLR基因的CRISPR/Cas9敲除载体及验证其编辑效率参照NCBI中猪APOE（GeneID:396801）和LDLR（GeneID:397576）基因序列信息，利用单链导向RNA(singleguideRNA,sgRNA)在线设计网站(http://crispr.mit.edu/)针对APOE第二外显子和LDLR第三外显子分别设计4个sgRNA靶向位点，合成sgRNA对应的两条（编码链和非编码链）短DNA序列并添加粘性末端，退火成双链(94℃,
10min;37℃,10min，4℃，保存)。用BbsⅠ限制性内切酶对pX458载体（带GFP荧光标记）做酶切回收，将酶切回收后的线性化载体与退火配对成双链的DNA序列进行连接，进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA，其特征在于：它包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示的APOE
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sgRNA2，和核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.15所示的LDLR
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sgRNA3。2.一种CRISPR/Cas9载体，其特征在于：它是连接有与APOE
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sgRNA2对应的双链DNA的载体，和连接有与LDLR
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sgRNA3对应的双链DNA的载体；所述APOE
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sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.10所示；所述LDLR
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sgRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.15所示。3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体，其特征在于：所述载体为pX458质粒载体。4.一种权利要求2或3所述CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜嘉祥，
申请(专利权)人：成都中科奥格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：