非天然氨基酸定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种基于遗传密码子扩展技术在口蹄疫病毒VP1蛋白的特定氨基酸残基定点引入提前终止密码子，利用生物正交翻译系统通读琥珀终止密码子UAG，在非天然氨基酸存在或不存在的条件下，不仅可以条件性的控制VP1蛋白的表达，将非天然氨基酸定点引入口蹄疫病毒VP1蛋白，还可利用含特殊基团的非天然氨基酸特异性标记口蹄疫病毒VP1蛋白，通过光照交联在与细胞内相互作用的蛋白质间形成稳定共价键，为口蹄疫病毒与宿主蛋白质相互作用研究提供有力的手段；也可用于制备VP1蛋白特定位点突变的复制缺陷型重组口蹄疫病毒及疫苗。病毒及疫苗。病毒及疫苗。

【技术实现步骤摘要】
非天然氨基酸定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及了一种基于遗传密码子扩展技术(The genetic code expansion，GCE)和生物正交翻译系统通读提前终止密码子(premature termination codons，PTC)，利用正交的非天然氨基酸(unnatural amino acids，UAAs)定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)为单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，由结构蛋白VP0、VP3和VP1组成，其中VP0蛋白由VP4和VP2组成。该病毒主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物，具有复制快、高度接触感染且致病性强等特征，尤其在猪群中能引起大范围流行。口蹄疫爆发会使动物及其产品贸易受到限制，造成重大的经济损失和社会影响，世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定必报传染病。VP1蛋白是FMDV的主要结构蛋白之一，含有特有的柔性loop结构(G
‑
H loop)上的RGD基序，是与细胞表面的整合素受体结合介导病毒与细胞吸附的关键基序，VP1蛋白还参与病毒入侵和免疫逃逸，是诱导宿主机体产生中和抗体的关键蛋白，是口蹄疫亚单位疫苗研制的首选蛋白。因此，深入研究FMDV VP1蛋白及其相互作用的蛋白质功能对解析FMDV与宿主相互作用机制具有重要意义。
[0003]近年发展起来的遗传密码子扩展技术(GCE)技术，是通过对蛋白质遗传编码的密码子表进行人为的扩展，引入新的编码规则，从而修饰或改变蛋白质的一种技术。该技术通过工程改造的氨酰基
‑
tRNA合成酶(aa
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tRNA synthetase,aaRS)/tRNA对实现。改造后的aaRS可将同源的tRNA与特定的UAA特异性氨酰化，专用于解码重新分配的密码子(通常为终止密码子，所匹配的aaRS/tRNA对称为无义抑制性aaRS/tRNA)。随后通过细胞核糖体识别tRNA
UAA
，允许UAA在翻译过程中对应指定的密码子并且能够位点特异性地掺入合成肽中。所有后生动物的蛋白质都是由20种经典氨基酸合成。这20种氨基酸的不同组合使蛋白质具有多种结构和功能，却同时限制了蛋白质特性的发展。尽管翻译后修饰机制在一定程度上解除了这种限制，但这依赖于极其强健且复杂的生物系统。利用遗传密码子扩展技术将UAAs直接掺入蛋白质中，大大扩展了蛋白质的特性，其允许在活细胞中将UAAs通过正交翻译系统特异的插入到任何蛋白质肽链上感兴趣的位点中。在目标蛋白质的基因组中引入琥珀终止密码子(TAG)，利用外源UAAs生物正交翻译系统来编码多种非天然氨基酸，并在生物活体内将其定点插入。这一技术已经将数百种UAAs(包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸)成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质。该技术可以有选择性将羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团引入蛋白质中，实现蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。同时，该技术还可应用在活体生物体(如病毒、细菌等)的定点标记、定点修饰、复制的控制等方面，已应用于多个领域，如遗传病的治疗，蛋白相互作用及生物医药领域。
[0004]PTC技术即为在病毒基因组中引入提前终止密码子(Premature termination codons，PTC)，以控制病毒的复制、蛋白表达，使其依赖于外源非天然氨基酸的病毒疫苗开发技术。将GCE技术和PTC技术真正应用于病毒疫苗的开发上，一个亟待解决的问题就是如何选择合适而高效的氨基酸突变位点。实现外源UAAs高效掺入和目标蛋白质的高水平表达，不仅有助于研究病毒蛋白质的生物学功能，也将大大促进PTC技术在病毒疫苗研发中的应用。
[0005]本专利技术首先基于蛋白质3D结构分析和软件预测分析，从VP1蛋白的氨基酸序列选择了15个氨基酸残基进行密码子点突变，从中筛选UAAs掺入效率较高的氨基酸位点。该突变方法为针对VP1蛋白中特定位点引入的非天然氨基酸，其特有的叠氮基团可以特异性地和荧光标记特定基团发生Click反应，从而可以在活细胞内标记VP1蛋白的定位。所述的非天然氨基酸定点修饰的FMDV VP1蛋白制备方法具有一下优势：1)在VP1蛋白的编码区中筛选出非天然氨基酸的高效插入位点，实现了细胞内VP1蛋白表达的条件性控制；2)通过非天然氨基酸定点修饰蛋白质的方法，实现了VP1蛋白的细胞内荧光标记；3)利用光交联非天然氨基酸的定点修饰，可以用于鉴定与VP1蛋白相互作用蛋白质复合物，从而确定关键互作蛋白；4)基于上述高效的氨基酸突变位点，可用于制备PTC重组FMDV，有助于病毒疫苗开发，具有广阔应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术发现，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FMDV VP1蛋白的第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L148位和L151位中至少一个位点的氨基酸残基的密码子突变为琥珀密码子TAG，利用生物正交翻译系统，可以在VP1蛋白中定点掺入非天然氨基酸，能够实现对VP1蛋白表达的条件性控制和细胞内荧光标记，也可以通过活细胞内光交联反应捕获与VP1蛋白互作的未知蛋白。
[0007]具体
技术实现思路
为：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种非天然氨基酸定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的口蹄疫病毒VP1蛋白第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L148位和L151位中至少一位氨基酸突变为非天然氨基酸。
[0009]优选地，所述非天然氨基酸包括：NAEK、DiZPK、DiZSeK、Bpa。
[0010]优选地，所述非天然氨基酸为NAEK和DiZPK。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种编码上述所述非天然氨基酸定点修饰的VP1蛋白的核酸分子。
[0012]优选地，所述核酸分子为：将编码SEQ ID NO.1的第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L148位和L151位氨基酸中至少一位氨基酸的密码子突变为密码子TAG。
[0013]第三方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的非天然氨基酸定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0014](1)将编码SEQ ID NO.1所示序列的第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、
L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非天然氨基酸定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的口蹄疫病毒VP1蛋白第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L148位和L151位中至少一位氨基酸突变为非天然氨基酸。2.如权利要求1所述的非天然氨基酸定点修饰的VP1蛋白，其特征在于，所述非天然氨基酸包括NAEK、DiZPK、DiZSeK、Bpa。3.编码权利要求1所述非天然氨基酸定点修饰的VP1蛋白的核酸分子。4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为将编码SEQ ID NO.1的第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L148位和L151位氨基酸中至少一位氨基酸的密码子突变为琥珀密码子TAG。5.如权利要求1所述非天然氨基酸定点修饰的口蹄疫病毒VP1蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将编码SEQ ID NO.1所示序列的第T43位、H59位、R67位、K81位、D85位、K96位、L98位、Y107位、P111位、R135位、R138位、P142位、R145位、L148位和L151位中至少一位氨基酸的密码子突变为琥珀密码子TAG，获得编码非天然氨基酸定点修饰的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，郝荣增，茹毅，卢炳州，毛玉涵，杨洋，李亚军，刘华南，李丹，冯涛，张越，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：