口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用；本发明专利技术通过确定口蹄疫A型病毒GH环表位多肽与口蹄疫O型非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题；但是缩减后对A型抗体的检测敏感性明显降低，进一步通过多聚抗原肽的形式展示多肽序列提高检测敏感性。最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及ELISA抗体检测试剂盒。本试剂盒对口蹄疫灭活疫苗免疫抗体和阴性血清检测总符合率较高达95％以上，但明显提高对口蹄疫合成肽疫苗免疫抗体的阳性检出率；可有效降低对口蹄疫病毒O型疫苗、猪口蹄疫病毒O型灭活疫苗免疫抗体的交叉反应。口蹄疫病毒O型灭活疫苗免疫抗体的交叉反应。

【技术实现步骤摘要】
口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫病毒包括7种血清型，目前我国主要流行O型和A型，两类病毒结构蛋白氨基酸序列相似度高，因此开发口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测试剂盒的最主要难点在于避免与不同血清型的抗体非特异反应，尤其目前我国在临床使用的口蹄疫A型疫苗均与O型疫苗构成多价疫苗，包括口蹄疫病毒OA二价灭活疫苗、口蹄疫病毒OA二价合成肽疫苗，这对试剂盒的检测特异性提出更高要求。
[0003]对现有专利文献进行检索发现，CN109485703A公开了一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽及其应用；CN106432434A公开了一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。该专利涉及口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列a(Tyr Asn Gly Thr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Ala ILe Arg Ala)、序列b(Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Arg Ala)、序列c(Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Sera La Ser Gln Asn Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala)中一种或几种组成的混合多肽，以及多肽在制备检测感染或免疫后产生的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体的试剂盒中的应用。
[0004]其缺点在于，在验证特异性反应时，并未验证对目前市场上正在使用的猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)免疫抗体交叉反应。事实上，所设计多肽与口蹄疫O型病毒对应位置(如口蹄疫O型病毒Re
‑
O/MYA98/JSCZ/2013株对应GH环序列为ValTyrAsnGlyLysCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuProAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAla GlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlaIleLysAla)存在完全一致的序列(如斜体部分序列)，尤其涉及N末端和C末端序列。而事实上本专利技术试验发现，该专利技术所选多肽序列a(对应本专利技术说明书表1PAF7204)、序列b(对应本专利技术说明书表1PWH0904)、序列c(对应本专利技术说明书表1PMM1304)的确能与猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗体非特异结合，在临床应用中将导致假阳性反应，阻碍临床评价疫苗真实免疫效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。本专利技术通过确定口蹄疫A型病毒GH环位置与猪口蹄疫O型合成肽疫苗和猪口蹄疫O型灭活疫苗抗体非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题。但是缩减后对A型抗体的检测敏感性明显降低，因此进一步通过多聚抗原
肽的形式展示多肽提高检测敏感性。最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及ELISA抗体检测试剂盒。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术提供一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列1所示，序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K。
[0008]还提供一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列2所示，序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K。
[0009]还提供一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列3所示，序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。
[0010]本专利技术还提供一种抗原包被板，所述包被板含有3条表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：
[0011]序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K；
[0012]序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K；
[0013]序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。
[0014]本专利技术还提供一种抗原包被板的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0015]S1、分别采用固相合成法合成所述表位多肽；
[0016]S2、将3种表位多肽混合，稀释后加入酶联反应板孔中进行包被、封闭、干燥处理，即得所述抗原包被板。
[0017]作为一个实施方案，步骤S1中，序列1的合成包括如下步骤：
[0018]1)合成得到全保护肽段1：
[0019]Fmoc
‑
Val
‑
Tyr(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
Gly
‑
Thr(tBu)
‑
Ser(tBu)
‑
Lys(Boc)
‑
Tyr(tBu)
‑
Ser(tBu)
‑
Ala
‑
Pro
‑
OH(保护肽片段1)；
[0020]2)合成得到保护肽段2：
[0021]Fmoc
‑
Ala
‑
Thr(tBu)
‑
Arg(Pbf)
‑
Arg(Pbf)
‑
Gly
‑
Asp(OtBu)
‑
Leu
‑
Gly
‑
Ser(tBu)
‑
Leu
‑
Ala
‑
OH(保护肽片段2)；
[0022]3)合成得到保护肽段3：
[0023]H
‑
Ala
‑
Arg(Pbf)
‑
Leu
‑
Ala
‑
Ala
‑
Gln(Trt)
‑
Leu
‑
Pro
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列1所示，序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K。2.一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列2所示，序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K。3.一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列3所示，序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。4.一种抗原包被板，所述包被板含有3条表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K；序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K；序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。5.一种根据权利要求4所述的抗原包被板的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、分别采用固相合成法合成所述表位多肽；S2、将3种表位多肽混合，稀释后加入酶联反应板孔中进行包被、...

【专利技术属性】
技术研发人员：仲从浩，张震，姬明放，王科，焦文龙，陈诚，殷波，丁举静，林烨，范可心，
申请(专利权)人：申联生物医药上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：