一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法技术

本发明专利技术公开了一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法，以GenBank公布的KM243095.1基因为参考序列，根据大肠杆菌密码子嗜性，优化目的基因序列，合成目的基因；将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，转入大肠杆菌构建pET32a

【技术实现步骤摘要】
一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法。

技术介绍

[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot
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and
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mouth disease virus， FMDV)感染偶蹄类动物后引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。家畜中牛、猪、山羊、绵羊等均为易感动物，严重危害畜牧业健康发展和公共卫生安全，我国将其列为一类动物疫病，目前控制该病的主要方法是抗体检测和疫苗免疫相结合。FMDV属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，主要有7个血清型，分别为A、C、O、SATI、SAT2、SAT3以及AsiaI型，不同血清型的FMDV之间无交叉保护性，引起我国牲畜发病的血清型主要有O、A、AsiaI三个血清型，其中O型流行最为广泛。VP1蛋白作为O型FMDV的主要结构蛋白，包含大部分刺激机体产生中和抗体的中和性抗原位点，因此VP1抗体作为FMDV免疫产生的主要中和抗体，是评估疫苗免疫效果的重要依据。
[0003]原核表达系统是目前应用最为广泛同时也是最为经典的表达蛋白方法，其具有基因表达量高、生长繁殖快、培养周期短、成本低、可以大规模生产等优点，但是大肠杆菌原核表达系统表达的外源基因的表达形式多为包涵体表达，虽然这种表达的优点是表达量大，但是缺点是表达的蛋白往往因为蛋白表达过快而折叠错误，造成蛋白的活性缺失，且纯化的蛋白需要复性才能够使用，而蛋白的复性效率并不高。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法，步骤如下：Step1、FMDV
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O
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VP1蛋白基因合成：根据GenBank公布的KM243095.1基因为参考序列，该O CATHAY分离株为我国猪群中流行的O型口蹄疫病毒的主要拓扑型，且该病毒的结构蛋白VPl暴露在病毒颗粒的表面，是诱导产生中和抗体的主要成分，该目的基因所表达的蛋白可用于后续的检测和治疗用抗体的研发。由于大肠杆菌在进化过程中形成了一套与其相适应的常用密码子，在蛋白质翻译过程中，由tRNA转运氨基酸至核糖体中，当外源基因的密码子所对应的tRNA在宿主细胞中的表达量低时，则会影响蛋白的表达效率，所以，根据大肠杆菌对其常用密码子的偏好性，即密码子嗜性，优化目的基因序列，合成目的基因KM243095，并在基因KM243095引入BamHI酶切位点、XhoI酶切位点、His标签和终止子。其中酶切位点用于将该段目的基因连接到载体上，在羧基端引入His标签和终止子更有利于标签的暴露，使得在后续用镍柱对该蛋白进行纯化时效果更好；Step2、pET32a
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VP1重组质粒的构建：将目的基因重组至pET32a(+)载体，该载体含有T7启动子、His和Trx标签，可以显著促进所表达的目的蛋白的表达量和可溶性，重组后将
质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，200r/min，37℃培养6h，12000r/min离心收菌体，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定并测序；Step3、FMDV
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O
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VP1蛋白诱导表达：将培养的菌液转移到含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，200r/min，37℃培养至OD
600
达到0.6
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0.8时停止培养；取部分菌液加入IPTG进行诱导表达，然后取诱导后的菌液于8000r/min离心5min，沉淀用超纯水洗涤1遍后用PBS溶液重悬，100℃煮沸10min，跑胶确定最佳诱导条件后大量诱导，收集菌体沉淀，冰浴超声破碎，跑胶确定蛋白表达形式，上清有表达；Step4、FMDV
‑
O
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VP1蛋白纯化：将上清过0.45μm滤膜，镍柱经平衡液平衡后上样，用不同浓度咪唑洗涤目的蛋白，收集洗脱峰，跑胶确定目的蛋白所在洗脱浓度，超滤浓缩。
[0006]优选的，Step1中，所述的目的基因编码序列由639bp碱基组成，优化序列为：将TAC优化为TAT，AAG优化为AAA，GAG优化为GAA，GAC优化为GAT，最终优化后形成的目的基因核苷酸系列号具体为：ACCACCTCTGCGGGCGAATCTGCGGATCCCGTGACCACCACCGTCGAAAATTATGGTGGTGAAACACAAGCCCAGAGGCGCCAGCACACGGATATAGCGTTCATACTGGATAGGTTCGTAAAAGTCAAACCAAAAGAACAAGTCAATGTATTGGATTTGATGCAGATCCCTGCCCACACCTTGGTAGGGGCGCTCCTGCGAACGGCCACCTATTATTTCTCTGATCTGGAACTGGCCGTCAAACACGAAGGCGATCTCACCTGGGTCCCAAACGGTGCCCCCGAAACAGCACTGGATAACACTACCAACCCAACAGCTTATCACAAAGAACCGCTCACAAGGTTGGCACTGCCTTATACGGCTCCCCACCGCGTCTTAGCGACCGTCTATAACGGGAGCAGTAAATATGGTGATGCCAGCGCTAACAACGTGAAAGGTGACCTTCAAGTGCTGGCTCAGAAGATAGAAAAAACTCTACCTACCTCCTTCAACTTCGGTGCCATTAAAGCAACCCGTGTGACTGAACTGCTCTATAGGATGAAAAGAGCCGAAACGTATTGTCCCAGGCCCCTTCTCGCCATTCAACCGAGTGATGCTAGACACAAACAAAAAATTGTGGCACCCGCAAAACAGCTTCTG。
[0007]优选的，Step3中，IPTG的终浓度为1mmol/L，诱导表达的条件为37℃诱导表达2h。
[0008]优选的，Step3中，冰浴超声破碎条件为功率250W，超声4s，停4s，破碎30min，菌液澄清透光，破碎后12000r/min离心10min。
[0009]优选的，Step4中，咪唑洗脱浓度为150mM。
[0010]优选的，Step4中，FMDV
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O
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VP1蛋白纯化的具体流程为：平衡
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上样
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二次平衡
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洗杂
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洗脱
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超滤浓缩。
[0011]与现有技术相比，本专利技术提供了一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法，具备以下有益效果：（1）本专利技术充分利用pET32a载体中的T7启动子、His纯化标签和Trx促溶标签的优点，T7启动子受控于T7 RN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达方法，其特征在于，步骤如下：Step1、FMDV
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O
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VP1蛋白基因合成：根据GenBank公布的KM243095.1基因为参考序列，根据大肠杆菌密码子嗜性，优化目的基因序列，合成目的基因，并在其中引入BamHI酶切位点、XhoI酶切位点、His标签和终止子；Step2、pET32a
‑
VP1重组质粒的构建：将目的基因重组至pET32a(+)载体，转化于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取单个菌落接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，200r/min，37℃培养6h，12000r/min离心收菌体，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定并测序；Step3、FMDV
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O
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VP1蛋白诱导表达：将培养的菌液转移到含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，200r/min，37℃培养至OD
600
达到0.6
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0.8时停止培养；取部分菌液加入IPTG进行诱导表达，然后取诱导后的菌液于8000r/min离心5min，沉淀用超纯水洗涤1遍后用PBS溶液重悬，100℃煮沸10min，跑胶确定最佳诱导条件后大量诱导，收集菌体沉淀，冰浴超声破碎，跑胶确定蛋白表达形式，上清有表达；Step4、FMDV
‑
O...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆意，李林，毛爱民，杨芝芬，李花，冯嘉林，周虹妤，
申请(专利权)人：无锡市水产畜牧技术推广中心，
类型：发明
国别省市：